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Nature发不停! MERFISH助力在长时记忆中神经元和星形胶质细胞相互作用的研究

2024-03-08

2024年2月7日，美国斯坦福大学生物工程系Dr. Stephen Quake和医学院分子与细胞生理学系的Dr. Thomas C Südhof 联合在 Nature 上发表了题为“Spatial transcriptomics reveal neuron-astrocyte synergy in long-term memory”的研究成果。该研究团队使用MERFISH空间转录组技术来研究长时记忆中神经元-星形胶质细胞的相互作用。这种技术可以在组织中以原位单细胞分辨率观察基因表达模式，从而揭示记忆形成过程中激活的特定细胞组群，证明了神经元和星形胶质细胞之间的协同作用在长时记忆中的重要性。为后续深入理解记忆形成的机制提供了新的视角，对进一步研究神经系统疾病和开发相关治疗方法具有重要意义。

研究背景

长期以来，科学家们一直在探索记忆形成和存储的机制，但神经元和星形胶质细胞之间的相互作用在这一过程中的具体作用尚不清楚。神经元是主要的信息传递单位，而星形胶质细胞则在维持神经元功能和调节神经环路中起着重要作用。这两种细胞之间的相互作用在长时记忆中的具体贡献仍然不明确。过去的研究主要集中在神经元的功能和相互连接上，而对星形胶质细胞的作用了解相对较少。越来越多的证据表明，星形胶质细胞在调节神经元活动、突触可塑性和记忆形成中发挥着重要的作用。因此，研究人员开始关注神经元和星形胶质细胞之间的相互作用，并利用空间转录组学技术来揭示它们在长时记忆中的协同作用。本文借助MERFISH空间转录组技术，同时检测细胞的位置和基因表达情况，对神经元和星形胶质细胞进行全面的分析，深入研究神经元和星形胶质细胞在长时记忆形成过程中的相互作用。

研究结果
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空间可视化分析印迹细胞

通过空间转录组学和单细胞RNA测序 (scRNA-seq) 分析了小鼠的杏仁核 (图1)。作为“恐惧训练和回忆”(FR) 条件的对照，使用了留在其原笼中的小鼠（HC），“无恐惧”(NF) 和“无回忆”(NR) 小鼠则暴露于所有操作中。本实验设计的目的是标记在回忆过程中被激活并变成tdT+的印迹细胞，能够识别在这些记忆印迹细胞中差异表达的恐惧特异性记忆基因。

为了可视化稀疏分布的印迹细胞的基因表达，文章中使用MERFISH技术，基于切片的分析提供了组织空间信息，并保留了天然细胞结构，提供单细胞分辨率原位研究捕获的(tdT+)印迹细胞（图1c），并且使用来自scRNA-seq数据的158个基因，文中从230多万个细胞中观察到10个主要类别，包括超过120万个神经元，形成至少23种类型 (图1d,e)和9个主要的非神经元细胞类型。在基底外侧杏仁核 (BLA)中鉴定了星形胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞、少突胶质细胞前体细胞 (OPCs)、内皮细胞、周细胞和八种神经元(两种兴奋性和六种抑制性)。神经元类型表达独特的标记基因，包括兴奋性神经元的Dkkl1和Tshz2，抑制性神经元的Npy、Htr3a、Pvalb、Sst、Baiap3和Six3 (图1f-h)。FR条件下的差异激活tdT+神经元可能与印迹细胞相对应，印迹细胞是持久记忆特征的一部分，因为在训练两周后建立记忆回忆，并在9天后分析基因表达。然而，在三种对照条件下对小鼠的处理，特别是在NF条件下，也可能激活与记忆无关的基因表达。由于这种情况，也可能是由于非特异性背景激活，即使在对照条件下也检测到一些tdT+细胞。因此，计算了NF和FR条件下tdT+细胞之间的差异表达基因(DEG)。由于这些 DEG 是在回忆9天后监测的，因此 DEG 很可能代表了在回忆期间作为先前恐惧记忆训练的功能而诱导表达的基因，并且在诱导后持续表达。在BLA中的15441个神经元中，FR条件下鉴定出358个(3.23%)tdT+神经元，而NF条件下鉴定出166个(2.06%)神经元 (图1c)。兴奋性神经元的差异基因表达分析发现，FR条件下早期反应基因(Dusp1和Fos)和神经肽基因Penk比NF条件下上调 (图1i)。与突触囊泡相关的基因(如Sv2c)和Penk在FR条件下比在NF条件下在抑制印迹神经元中上调，而神经肽基因速激肽2（Tac2）则下调。

图 1. 空间转录组学解析印迹细胞和记忆基因

印迹细胞相关基因的表达

为了深入研究印迹细胞，文章使用了full-length deep scRNA-seq，平均每个神经元检测 9144 个基因。分析了 6361 个BLA细胞的转录组，从而能够识别所有主要细胞类型，包括神经元(Rbfox3+)、星形胶质细胞(Slc1a3+)、小胶质细胞(Ctss+)、少突胶质细胞(Plp1+)、OPCs(Cspg4+)、内皮细胞(Cldn5+)和室管膜细胞(Kcnj13+) (图2a、b)。然后分析了哪些基因表征tdT+细胞。除了tdT，编码神经肽的基因如 Tac2 和 Nr4a1在tdT+神经元中富集。这些基因在FR和NF条件下都被一致地观察到 (图2c)，但在HC和NR条件下没有被观察到 (图2d)，这表明在NF条件下将小鼠置于恐惧调节室的经历足以诱导基因表达的长期变化。为了确定印迹神经元中远端记忆回忆特异性诱导的转录变化，筛选了FR小鼠与NF小鼠捕获tdT+神经元中的 DEG。单细胞分辨率可以对相同类型的神经元进行比较，全长mRNA测序提供了与记忆巩固和回忆特异性相关的基因的高灵敏度鉴定。采用严格的标准去除非特异性 DEG。首先，去除FR与NF小鼠中未捕获细胞之间差异表达的 DEG，从而将基础激活的影响降至最低。其次，只包括FR细胞与NR和HC对照时差异表达的 DEG，确保 DEG 不仅仅是恐惧经历的结果。最后，每个 DEG必须在至少四分之一的细胞中表达，并且至少有1.75倍的变化。这些严格的标准在6种类型的神经元中确定了107个“远端记忆相关 DEG” (图2e)。对FR和NF之间这些捕获的tdT+抑制性神经元亚型的差异分析发现了159个与记忆巩固相关的基因 (图2f)。CREB信号通路广泛涉及长时记忆巩固。虽然IEGs与突触可塑性广泛相关，但除了突出性单独诱导的IEGs子集外，还受长时恐惧记忆巩固的调节，包括Ier2，Egr1，Jun，Junb，Dusp1和Npas4基因 (图2f)。总之，这些数据表明，印迹神经元在记忆巩固过程中改变神经肽的产生，暗示神经肽是长时记忆形成的关键因素。神经元通常表达多种神经肽，这些神经肽在神经元激活时释放，并通过与 G 蛋白偶联受体结合来刺激靶细胞中的多种信号通路，以控制神经活动和突触可塑性，这些过程对记忆形成和情绪行为至关重要。因此，神经肽在恐惧记忆中发挥重要作用似乎是合理的，这表明它们可能在印迹神经元激活之外控制细胞信号传导。此外，更多的与远端记忆相关的 DEG 中，有一半以上与痴呆、癫痫、精神分裂症和I型和II型腓骨肌萎缩症等神经紊乱有关。这表明这些基因在调节远端记忆方面的功能与它们参与神经系统疾病的发展之间存在潜在相关性。

图 2. 记忆巩固引发细胞的特异性转录

星形胶质细胞的重塑

神经元-神经胶质相互作用被认为在记忆巩固中起着至关重要的作用。发现在非神经元细胞中，只有星形胶质细胞表现出与远端记忆巩固相关的一致的转录变化 (图3)。星形胶质细胞与神经元和其他类型的胶质细胞进行局部相互作用。这些相互作用可以感知和调节神经回路活动，并有助于大脑中的信息处理，包括记忆巩固。值得注意的是，记忆巩固促进了从Astro_2到Astro_5细胞的过渡，减少了Astro_1细胞的比例 (图3a)。在FR条件下，Astro_1细胞活性明显降低，而Astro_5细胞活性高于NF条件下，这表明记忆巩固将活跃的星形胶质细胞从Astro_1状态转移到Astro_5状态 (图3b)。即星形胶质细胞类型在恐惧记忆巩固过程中被重塑 (图3a)。在基础条件下，Syne1在星形胶质细胞中的表达在BLA中相对较低，但在FR条件下被诱导表达 (图3c)。

图 3. 远端记忆巩固激活星形胶质细胞

星形胶质细胞与神经元的相互作用

为了从功能上评估星形胶质细胞的激活是否有助于记忆的形成，使用Ca²⁺atp酶CalEx的表达选择性地抑制了恐惧记忆形成过程中BLA中星形胶质细胞的激活，该酶可以从星形胶质细胞中去除钙离子 (图4a,b)。在恐惧条件训练后，小鼠被双侧注射在星形细胞特异性GfaABC1D启动子控制下表达CalEx的腺相关病毒(aav)，以mCherry作为标记，tdtomato作为对照。21天后，小鼠接受情境记忆在原始环境中进行测试，然后在改变的环境中进行测试，之后进行暗示恐惧条件反射测试和开放场地测量 (图4a)。发现，星形胶质细胞激活的抑制损害了情境和线索恐惧条件反射记忆，而对改变的情境的反应保持不变且较低 (图4b)。文中测试了一个特定的空间细胞环境是否可能与印迹神经元有关。通过分析BLA中tdT+神经元周围的细胞 (半径为30µm) (图4c)，检测到印迹周围星形胶质细胞中 Igfbp2 (编码胰岛素样生长因子结合蛋白2) 的富集表达。而印迹周围神经元的基因表达模式与其他神经元的基因表达模式无法区分 (图4d)。作者发现，与NF条件相比，周围印记星形胶质细胞在FR条件下表现出更高的Fos激活 (图4e)。MERFISH 空间转录组学数据不仅定位了稀疏的印迹细胞，识别了印迹细胞附近的细胞特征，而且概括了印迹细胞结构和基因表达，以及记忆巩固对星形胶质细胞的激活。为了确定 Igfbp2在印迹周围星形胶质细胞中表达增加对记忆形成的功能意义，在诱导恐惧记忆之前删除了BLA中的 Igfbp2。在恐惧训练前7天将编码对照或 Igfbp2特异性gRNA的 aav 注射到表达Cas9的小鼠的BLA中 (图4f)。训练后三周，在情境记忆范式中评估这些小鼠，使用原始和改变后的情境，然后进行暗示恐惧条件反射测试和开放场测试 (图4f)。BLA中的 Igfbp2 敲除导致情境和线索恐惧条件反射的明显缺陷 (图4g)。然而，对改变的环境的反应一直很低，甚至没有变化 (图4g)。

图 4. 星形胶质细胞的激活调节长时记忆

mPFC和BLA之间的记忆联系

来自PFC (前额叶皮层) 和BLA的4603个神经元的scRNA-seq数据被用于将神经元聚类成7个群体，每种细胞类型都有明确的标记。值得注意的是，7种神经元中有6种同时存在于BLA和PFC，只有Gpr88神经元特异于BLA (图5a、b)。接下来，检查了每种类型的神经元的捕获神经元中FR诱导的转录变化。综合差异表达分析鉴定出1673个基因在BLA和mPFC中都发生了显著变化 (图5c)。出乎意料的是，1587个(94.9%) DEG 在同一方向上被共同调节 (图5d)。这表明，记忆巩固驱动了跨多个大脑区域的印痕神经元中的保守转录程序。与上述分析一致，与囊泡胞吐和突触形成相关的DEG上调。此外，在三种最丰富的神经元类型 (EX.Znt3, Int。Vip和EX.Syt6)，发现32个基因的表达在BLA和mPFC中都受到长期恐惧记忆的调节 (图5e)。这些数据揭示了在记忆巩固过程中，BLA中的印迹神经元与星形胶质细胞进行多方面的相互作用。特别是，印痕周围星形胶质细胞释放的Igfbp2影响神经元，而神经元分泌的神经紧张素在记忆巩固过程中作用于星形胶质细胞。

图 5. PFC与BLA之间的联系

MERFISH 的价值

利用MERFISH技术最终得到的超高分辨率脑细胞空间表达谱，在原位对神经元和星形胶质细胞进行了全面解析，阐明长时记忆中神经元与星形胶质细胞存在协同作用。这些结果为深入理解记忆形成的机制提供新视角，对神经系统疾病开发新治疗方法提供新策略。

2021年，Vizgen率先将整合了MERFISH与超分辨率成像技术的分析系统MERSCOPE™推向市场，基于核心技术MERFISH技术，MERSCOPE™可在1天内对1cm²的组织进行超分辨成像，分辨率100nm，定位单细胞中RNA的空间分布以及定量基因表达。实现真正意义上的原位单细胞空间转录组分析，让基因的表达和定位可视化，推动基因组学的研究步入下一代。

基因有限公司于2022年3月正式签约成为美国Vizgen公司MERSCOPE™超分辨显微成像分析系统在中国区的合作伙伴。负责该仪器的售前技术咨询、售后安装培训、应用支持等工作。同时，上海贝晶生物技术有限公司也提供MERFISH技术服务。想要了解关于更多有关MERFISH的技术信息，可添加下方微信。

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