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NanoDrop 205 nm处定量蛋白质和肽制剂
简介 蛋白质定量方法有多种可以选择，包括重量法、比色法、直接分光光度紫外法(如A280)和氨基酸分析，所有这些方法都有其优点和缺点。微量分光光度紫外测量是研究人员的热门选择，因为其操作简单，不需要试剂或标准品，并且消耗很少的样品。NanoDrop One分光光度计具有预先编程的应用程序(图1)，用于在280 nm和205 nm处测量吸光度直接定量蛋白质。 蛋白质的肽骨架吸收深紫外区(190nm - 220nm)的光，该吸光度可用于蛋白质样品定量。与直接测定A280蛋白的方法相比，A205蛋白定量方法有几个优点，如蛋白间变异性较低(因为A205消光系数不是基于氨基酸组成)和灵敏度较高(因为蛋白质在205 nm处具有较高的摩尔吸收率)。然而，由于技术上的限制，过去很难获得这些测量结果。如今，NanoDrop One专利的样品保留技术和低杂散光性能简化了A205方法对少量蛋白质的定量。本篇推文具体描述了如何使用Protein A205应用程序来定量蛋白质样品。 图1.NanoDrop One Proteins主屏幕显示可用的蛋白质定量预编程应用程序。
用于肽和蛋白质测量的 A205程序 NanoDrop One Protein A205应用程序支持三种不同的选项(图2)。所选选项将自动确定消光系数，该消光系数将用于根据样品在205 nm处的吸光度计算蛋白质浓度。 • ε₂₀₅=31 method • Scopes method² • Other = custom method ε₂₀₅1mg/mL 大多数1 mg/mL 蛋白质溶液的消光系数 (ε2051mg/mL) 范围为 30 至 35²。ε₂₀₅ 31 mL mg-1cm-1的消光系数通常用于缺乏色氨酸和酪氨酸残基的肽。Scopes 方法可提供更准确的 ε205，特别是对于含有大量色氨酸 (Trp) 和酪氨酸 (Tyr) 残基的蛋白质。因为该方法在其方程中使用 A280/A205 比率来校正色氨酸和酪氨酸侧链吸光度³。 本方法适用于氨基酸序列已知的蛋白质或多肽的纯制备。 图2.NanoDrop One Protein A205方法选择界面 NanoDrop One A205的性能测定 在0.01%Brij®35缓冲液中制备多粘菌素制剂，该制剂是一种具有肽骨架但没有Trp或Tyr残基的抗生素，在NanoDrop One和Thermo Scientific™Evolution™紫外可见分光光度计上进行测量。将 2 µL 样品直接移液到 NanoDrop One 样品基座上，而在 Evolution 分光光度计上测量则使用 10 mm 石英比色皿测量。绘制了两台仪器上获得的多粘菌素浓度数据（表 1，图 3）。 表1显示，NanoDrop One仪器在205 nm的重复测量之间提供了非常一致的结果，标准偏差低于0.04A。回归线显示 NanoDrop One 仪器的蛋白质浓度结果与使用比色皿的传统高端紫外-可见分光光度计获得的结果非常一致。 表1.在 NanoDrop One 和 Evolution 分光光度计上测量了多种多粘菌素制剂。使用ε₂₀₅=31 应用程序在 NanoDrop One 仪器上测量每种溶液的五次重复。稀释吸光度超过 1.0A 的溶液，并在 Evolutio 分光光度计仪器上重复测量三次。 图3.用Evolution分光光度计和NanoDrop One仪器计算多粘菌素浓度。 为了评估在205 nm处使用Scopes和ε₂₀₅=31两种方法对结果的影响，制备了具有不同量芳香残基的三种不同蛋白质的稀释液：牛血清白蛋白（BSA，3个Trp和21个Tyr残基）、溶菌酶（6个Trp，3个Tyr残余基）和多粘菌素（无Trp，无Tyr）。这些制剂在NanoDrop One仪器上使用ε₂₀₅=31和Scopes方法检测结果见表2。 A205检测方法（Scopes和ε₂₀₅=31）显示色氨酸和酪氨酸残基的数量对计算的浓度有很大影响（表2）。这是因为色氨酸是 A280 吸光度的最大贡献者，而 Scopes 方法可使用 A280/A205 比率来校正 A205 处的芳香族侧链吸光度。 研究结果表明，当蛋白质只有少量色氨酸残基时，使用ε₂₀₅=31方法对A205进行定量可以得到可靠的结果。 表2.不同A205方法在NanoDrop One分光光度计上测定各种蛋白质和肽制剂的比较。 注意事项 许多常用的蛋白质缓冲液在205nm有吸光度，在使用该技术之前，建议检查蛋白质缓冲液对205nm吸光度的影响。
参考文献： 1. Anthis, NJ and Clore, GM 2013. Sequence-specific determination of protein and peptide concentrations by absorbance at 205 nm. Protein Science 22:851-858. 2. Goldfarb, AR, Saidel, LJ, Mosovich E 1951. The ultraviolet absorption spectra of proteins. Journal of Biological Chemistry 193(1):397-404. 3. Scopes, RK 1974. Measurement of protein by spectrophotometry a 205 nm. Analytical Biochemistry 59:277-282 关于我们 基因与Thermo 基因有限公司自2004年成为NanoDrop Technologies公司（2007年被Thermo Fisher Scientific公司并购）在中国区的合作伙伴，至今已有近20年的合作历史，负责NanoDrop全系列产品线的售前咨询、售后安装、应用培训和维修维护等服务。目前在中国有数万台装机，服务了几十万用户。 联系下方产品专员进行试用吧！ 关于基因 基因有限公司成立于1992年，是一家提供生命科学科研仪器、试剂耗材和技术服务的综合服务商。基于“Gene Brightens Every Life • BioTech Connects the World”——“基因燃亮生命 • 生物技术连接世界”的愿景，专注于生命科学领域前沿技术的引进和推广，致力于推动该领域国内科研机构硬件水平及实验方案的革新与升级。同时，公司也一直致力于自主品牌的科研设备的研发与生产，拥有一系列通用性强、互补性高的自主品牌产品。 基因的服务网络遍及全国各地十多个大中城市，拥有包括仪器销售，试剂销售，市场与技术支持，维修，客服，物流等多个部门组成的完整服务体系。 我们希望通过不懈努力，为您的成功铺路搭桥，也为中国的生命科学事业赶超世界先进水平尽一己之力。欲了解更多信息，请访问www.genecompany.cn。
