单细胞原位空间转录组研究为复杂生物学提供了强大的见解，而基因panel的设计是检测基因表达、鉴定细胞类型、分析细胞互作及细胞空间临近关系的基础，是开展单细胞原位空间转录组研究必不可少的前提条件，对此，Vizgen公司为基因panel设计提供灵活解决方案，既可完全个性化定制基因panel，还可提供预制的基因panel，从而帮助科学家们更加便捷地开启MERFISH单细胞原位空间转录组研究。

一、定制基因panel规格：

• 最多1000个基因

• 最多500个基因

• 最多300个基因

• 最多140个基因

二、预制基因panel类型：

• 预制人肿瘤通路基因panel

• 预制小鼠神经细胞类型基因panel

• 预制人免疫-肿瘤基因panel

• 预制人肝癌-免疫图谱基因panel

       小鼠神经细胞类型预制基因panel是针对小鼠脑的主要细胞类型markers，包含500个基因，是根据已发表的大规模scRNA-seq和空间转录组数据集筛选的细胞亚型标记基因以及具有成熟神经功能的基因，例如神经递质、神经肽、受体、离子通道和神经元活性相关基因等，兼容新鲜冰冻、固定冰冻以及细胞样本类型，可以用于细胞类型鉴定和聚类分析、确定神经元亚型、神经细胞信号传导以及探索细胞功能与细胞间互作等。

表1.小鼠神经细胞类型基因panel中包含的部分神经功能相关基因列表。

       人肿瘤通路预制panel是参考公认的肿瘤学数据库OncoKB，MutSig，The Cancer Genome Atlas3，Hallmarks of Cancer进行设计，用以表征RAS/RTK、PI3K、NOTCH、MYC、Cell Cycle、HIPPO等主要的肿瘤信号通路，包含500个基因，涉及癌症经典信号通路相关基因，肿瘤学通路相关基因，免疫特异性markers以及突变显著性基因等，兼容人类乳腺癌、肺癌、肝癌、前列腺癌、结肠癌、黑色素瘤、卵巢癌和脑癌8种不同的癌症样本，可适用于新鲜冷冻、固定冷冻、培养的细胞和FFPE组织类型，用以探索肿瘤生物学以及肿瘤细胞与基质细胞以及与免疫细胞的相互作用，在单细胞和亚细胞水平表征肿瘤行为。

表2.人肿瘤通路预制panel中包含的基因集列表。

       人免疫-肿瘤的预制基因panel是参考公认的Hallmarks of Cancer数据库和已发表的前沿文献进行设计，包含500个基因，是对癌症免疫反应相关的关键基因，包括细胞类型相关基因，细胞因子信号转导相关基因以及免疫检查点分子基因等，兼容人类乳腺癌、肺癌、肝癌、前列腺癌、结肠癌、黑色素瘤、卵巢癌和脑癌8种不同人的癌症样本，可适用于新鲜冷冻、固定冷冻、培养的细胞和FFPE组织类型，以识别主要免疫细胞类型和亚型，表征肿瘤微环境中复杂的肿瘤免疫系统的相互作用关系。

表3. 免疫-肿瘤预制基因panel中包含的部分基因集和基因列表。

       人肝癌-免疫图谱的预制基因Panel是与Mount Sinai Miriam Merad团队联合开发，参考了今年6月份发表在Nature Medicine上的文章“Intratumoral dendritic cell - CD4+ T helper cell niches enable CD8+ T cell differentiation following PD-1 blockade in hepatocellular carcinoma”中使用的基因Panel，包含400个基因，包括用于识别免疫细胞和免疫细胞状态的基因以及在肝细胞癌患者中PD-1阻断的应答者与非应答者中差异表达的大量基因等，可适用于新鲜冷冻、固定冷冻、培养的细胞和FFPE组织类型，以进行细胞聚类,解析肝肿瘤和免疫细胞亚型，探索细胞功能，研究肝癌微环境、免疫图谱。

下面让我们一起看一下预制panel的MERFISH数据质量到底如何？

      Vizgen公司基于人免疫-肿瘤的500个基因的预制panel通过MERSCOPE平台对来自8种不同的人肿瘤样本的16张组织切片进行MERFISH实验，共检测到40亿多个转录本、分析了接近900万个细胞。

       经验证，人免疫-肿瘤预制panel数据集具有非常高的数据质量，如图所示，两张相邻组织切片的MERFISH结果相关性高达0.99，表明MERFISH数据具有非常高的可重复性，并且，与Bulk RNA-seq结果相关性都在0.7以上，表现出高质量的数据结果。

图1A显示两张人卵巢癌组织切片MERFISH结果相关系数0.99；1B显示人卵巢癌组织切片MERFISH结果与Bulk RNAseq结果相关系数0.82；1C显示8种肿瘤组织MERFISH结果与Bulk RNAseq结果相关系数在0.7至0.82之间，呈现出较好的一致性。

图2A显示人肝癌组织切片的细胞边界染色，红色显示的为胞膜，蓝色显示的为胞核；图2B多边形用以显示不同的细胞边界；2C显示鉴定出的17种不同的细胞类型的UMAP图；2D显示2B图框选区域中细胞类型的空间分布；2E显示2B图框选区域中成纤维细胞的空间分布；2F显示2B图框选区域中内皮细胞的空间分布。

图6A显示对T细胞和NK细胞进行亚聚类分析得到的7种不同的免疫细胞亚型；6B显示每种细胞类型特异性表达的marker基因；6C和6D分别显示Treg细胞以及CD4阳性T细胞乳腺癌组织中的空间分布；6E显示CD4(绿)、CD8A(蓝)、FOXP3(红)、NCR1(黄)以及CTLA4(白)几个基因的空间分布。注意FOXP3阳性的Treg细胞里面表达T细胞衰竭marker CTLA4，黄色箭头所示为NK细胞。

      为评估神经细胞类型panel的有效性，Vizgen使用MERSCOPE®️平台分析了来自两只成年C57B6小鼠大脑的16个矢状面和11个冠状面新鲜冷冻脑切片，进行MERFISH成像、解码和细胞分割后，生成单细胞基因表达谱并进行下游分析。

图1：在MERSCOPE®平台上使用神经细胞类型基因panel生成小鼠脑细胞图谱的实验设计。

      使用神经细胞类型panel从每个小鼠脑切片检测到2000万-1亿个转录本，相邻脑切片之间的数据相关性为0.99，具有较高的可重复性。MERFISH数据与RNA-seq数据的相关性为0.7-0.8，并且，神经细胞类型Panel具有很高的检测效率，可以可靠地检测到低表达基因(FPKM 0.05-1)。此外，检测到的脑区域特异性基因的空间分布显示出清晰的脑区域特异性表达模式，且与传统原位杂交测定的空间分布一致。这些结果证实，在MERSCOPE®平台上使用神经细胞类型panel可以准确检测组织环境中的基因表达。

图2.神经细胞类型panel忠实地检测小鼠大脑中的基因表达。