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分子诊断 | 阐明CRISPR/Cas系统在等温扩增核酸检测中的应用
CRISPR/Cas系统作为一种源自原核生物获得性免疫系统的基因定点编辑技术，它是用短RNA序列来作为特异性识别单位，进而被激活后使目标位置的双链DNA断裂。由于该技术具有操作简便、灵敏度高、抗干扰性强 等优势，已经开始应用于体外核酸分子检测领域。 由于传统核酸分子检测是基于PCR（聚合酶链式反应）技术，该技术操作复杂、仪器昂贵、涉及多重变温 过程，所以不适用于基层检测和家庭检测。 为了克服 PCR 需多重变温的弊端，等温扩增检测技术在核酸分子检测领域得到了广泛关注，但等温扩增技术在灵敏度、特异性和抗干扰度方面却有着其内在缺陷，而利用CRISPR/Cas系统可识别并结合外源入侵的核酸分子，将其与等温扩增相结合应用于核酸检测中，为提高检测灵敏度及特异性等性能指标提供了一种新思路。 相关研究： 《A CRISPR–Cas9-triggered strand displacement amplification method for ultrasensitive DNA detection》 2018年喻学锋课题组在Nature Communications创新性地提出利用CRISPR-Cas9技术在与靶核酸分子结合过程中独特的构象变化，作为链取代等温扩增反应的开关，高效启动针对靶核酸分子的指数倍扩增（简称CRISDA技术）。CRISDA技术优势：该技术灵敏度高，特异性强，普适性极强。除此之外，该技术检测过程完全等温，并且在从室温到42℃的范围内均保持良好的扩增检测效果，可充分满足在实际检测中对新靶点的检测需求。 《Amplified detection of nucleic acids and proteins using an isothermal proximity CRISPR Cas12a assay》 在该文中描述了一种等温扩增结合CRISPR Cas12a检测方法，此方法利用靶向诱导的Cas12a ssDNase活性，在mRNA水平上对基因表达进行定量分析，并以高灵敏度和特异性检测蛋白质表达水平。目标识别是通过接近结合而不是通过特异性识别来实现的。结合诱导的引物延伸反应用于生成预先设计的CRISPR靶标序列，作为进一步信号扩增的条形码。通过这种双扩增方案，能够等温检测低至1 fM的靶核酸和100 fM的靶蛋白。 《Elucidating the Role of CRISPR/Cas in Single-Step Isothermal Nucleic Acid Amplification Testing Assays》 2023年2月，约翰霍普金斯大学生物医学工程系的邵方驰教授及其团队通过开发和比较具有相同重组酶聚合酶扩增（RPA）但CRISPR/Cas12a不同的分析方法，并进行了系统的研究。该研究阐明了 CRISPR/Cas12a 在一步分析中与 RPA 结合时的作用和影响。从设计、操作、信号、灵敏度、速度和成本6个方面的比较表明，相对于无 CRISPR/Cas12a 检测，PAM CRISPR/Cas12a 辅助 RPA 检测实际上仅提高了信号（没有提高任何一种灵敏度或速度）以显著增加成本为代价，而无 PAM CRISPR/Cas12a 辅助 RPA 测定进一步提高了信号并略微提高了灵敏度和速度，但成本适度增加。该研究揭示了CRISPR/Cas在一步等温扩增测定中的作用和新的影响。 EnGen® Lba Cas12a (Cpf1) 为助力核酸分子检测新技术的开发和深入，NEB在基因编辑上提供了完善的解决方案，值得一提的是：EnGen® Lba Cas12a (Cpf1) EnGen® Lba Cas12a (Cpf1)是一种可编程的DNA内切酶，由单个guide RNA (gRNA)引导。靶向结合与目标位点互补的gRNA以及目标序列互补DNA链上的5' TTTV原间隔邻近基序列(PAM)。EnGen® Lba Cas12a (Cpf1)在PAM的约17个碱基3′处进行切割，并留下5′悬垂端。 特点： 富含T的TTTV - PAM序列,开辟了额外的靶向基因组区域； 较短的guide RNA：40-44个碱基； 两个核定位信号，用于改善细胞核的运输； 裂解产品中含有5 '突出末端； 在16~48°C范围内有效； 与酸性球藻直属同源物相比，它能在较低温度下保持活性，可以在斑马鱼和异种鱼等变温生物中进行编辑； 高浓度液体格式可用于微注射、电穿孔和脂质体感染。
基因公司作为NEB杰出代理商，始终保持着一致的合作步调。在分子诊断、基因编辑领域均可为您提供解决方案。 Science Technology 如有问题或需求 欢迎添加基因产品经理进行技术咨询
