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PacBio 样品质控要求---DNA 样品质控
PacBio 官方手册 Technical Notes 介绍推荐样品提取试剂盒，样品质控要求等内容。 https://www.pacb.com/wp-content/uploads/Technical-Note-Preparing-DNA-for-PacBio-HiFi-Sequencing-Extraction-and-Quality-Control.pdf
01 Genomic DNA Sizing Characterization 基因组定性要求 推荐Agilent Femto Pulse 质控要求： ■ 无降解双链DNA ■ 大基因组 动植物/人 GQN at 30 kb ≥5.0 GQN at 10 kb ≥9.0 ■ 小基因组 微生物/宏基因组 GQN at 7kb ≥9.0 仪器优势： ■ 检测~165kb 片段 ■ 上样量低 <1ng 样品 ■ 检测速度快 ，<1.5h 运行分析时间 脉冲场电泳在DNA 长片段检测中是金标准。但是上样量需要>50ng，运行时间16h。 而FP 的优点是上样量低，小于1ng，检测速度快，1.5h 完成运行和分析。 非常符合测序质控需求。 下图，A 是脉冲电泳结果 B 是FP 运行结果 3A和1B 是高质量DNA -- 基因组完整 （有主峰>30kb） 4A和 2B 降解DNA -- 弥散严重 A和B 比较 FP是完全可以替代脉冲，且效果相当。 基因组完整性 判断标准
例如下图： 基因组 主峰在 146kb，30kb以上分布 81%，10kb以上分布 89%。 基因组完整性非常好。 02 DNA Quantification DNA 定量 推荐Life Qubit 4 仪器优势： ■Qubit 4 检测靶标特异性荧光染料。 这些荧光染料只有与靶分子结合时才会发射荧光信号。 ■ 荧光法检测双链DNA量 配合HS dsDNA kit 使用 03 DNA Purity Determination DNA 纯度 推荐Thermo NanoDrop One 质控要求 ■ OD260/280 1.8-2.0 ■ OD260/230 2.0-2.2 仪器优势： ■ 上样量低 1-2ul 样品 ■ 检测速度快 ND 样品纯度 判断标准
260/280 低 可能蛋白/苯酚污染 260/280 高 可能 RNA污染 260/230 低 碳水化合物残留（通常成熟植物组织） 苯酚、胍和乙醇残留（通常柱膜试剂盒） 糖原残留 （通常助沉剂） 260/230 高 仪器基座脏污 使用不合适的溶液进行空白测量 重要纯度参考值
浓度 |NanoDrop-Qubit| / Qubit < 0.5
建议： 若是不满足上述参考值，首先使用Qubit 检测RNA污染。如果没有RNA污染，则建议至少进行一到三轮标准0.45XAMPure®PB磁珠纯化，直到浓度差异小于50％。如果经过三轮纯化后仍不能改善，请尝试使用市售试剂盒，异丙醇沉淀或新的DNA提取方法可获得更清洁的DNA。如果样品中有RNA，则先用RNase A再用标准0.45X AMPure PB磁珠纯化。 总结 基因组质控要求 基因有限公司作为PacBio中国区代理商，自2011年以来将PacBio第三代单分子实时测序技术引入国内，一直为国内用户提供专业的三代测序系统的安装培训，技术支持，应用培训与售后维护工作，赢得客户的一致好评与信任。基因有限公司将一如既往的支持越来越多的PacBio用户。 关于基因 基因有限公司成立于1992年，是一家提供生命科学科研仪器、试剂耗材和技术服务的综合服务商。基于“Gene Brightens Every Life • BioTech Connects the World”——“基因燃亮生命 • 生物技术连接世界”的愿景，专注于生命科学领域前沿技术的引进和推广，致力于推动该领域国内科研机构硬件水平及实验方案的革新与升级。同时，公司也一直致力于自主品牌的科研设备的研发与生产，拥有一系列通用性强、互补性高的自主品牌产品。 基因的服务网络遍及全国各地十多个大中城市，拥有包括仪器销售，试剂销售，市场与技术支持，维修，客服，物流等多个部门组成的完整服务体系。 我们希望通过不懈努力，为您的成功铺路搭桥，也为中国的生命科学事业赶超世界先进水平尽一己之力。欲了解更多信息，请访问www.genecompany.cn。
