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LI-COR Odyssey助力FAT10和NUB1L协同激活26S蛋白酶体的研究
LI-COR Odyssey采用双色近红外荧光成像技术，可在一次实验中检测多个目标蛋白，获得稳定且可重复的实验数据，保证是实验结果的一致性。与此同时，Odyssey拥有宽广的动态范围，能够同时获得低丰度和高丰度蛋白的表达信息，避免产生信号过曝的情况。随着近红外成像技术的推广普及，越来越多的期刊杂志推荐使用Odyssey来进行Western Blot实验，近期一篇名为“FAT10 and NUB1L cooperate to activate the 26S proteasome”发表在Life Science Alliance期刊中，揭示了26S蛋白酶体的激活机制。 26S蛋白酶体通过其19S调节颗粒与泛素化蛋白的相互作用，打开20S的核心颗粒，同时通过泛素链与19S调节亚基RPN1的共同作用，抑制去泛素化酶USP14的结合，从而增加其蛋白降解的活性。蛋白酶体降解的另一种方式是用细胞因子诱导泛素样修饰物FAT10对蛋白质进行共价修饰。这篇文章揭示了FAT10与其相互作用的NUB1L以泛素和USP14非依赖的方式，打开20S蛋白酶体的结构。同时发现FAT10能够通过与NUB1L的UBA结构域结合，从而干扰NUB1L形成二聚体，进而激活26S蛋白酶体有关水解肽的活性，但FAT10只能与NUB1L一起激活。FAT10与NUB1L的结合将会增加NUB1L对RPN1亚基的亲和力。总而言之，这篇文章揭示了FAT10和NUB1L的协同作用诱导激活26S蛋白酶体的机制。
部分结果展示
FAT10和NUB1L共同激活26S蛋白酶体 结合之前的研究结果，异位表达的FAT10在酵母中降解，非内源性NUB1L加速其降解的程度与哺乳动物细胞中的降解程度相似(Hipp等人，2004；Rani等人，2012)。与野生型（WT）酵母相比，转导HA标记的FAT10在开放状态的突变株中降解率增加。NUB1L在WT酵母中的共表达增加了FAT10的降解，产生了在没有NUB1L的开放状态突变体中更高的降解率，此时的NUB1L没有加速该突变体中FAT10的降解(图1A和B)。这一结果表明，介导NUB1L加速FAT10的降解是通过20S复合体中开放状态来完成的。 图1。开放状态的蛋白酶体和WT蛋白酶体对FAT10的降解。作者通过LI-COR Odyssey进行Western Blot实验，并使用Image Studio Lite Version 5.5进行定量数据分析。(A)对具有两个环己酰亚胺的样品进行了Western Blot实验。左侧将HA-FAT10 Met载体导入酿酒酵母，检测4h内FAT10的降解情况，右侧将相同载体导入开放状态的20S蛋白酶体，形成酵母突变体α3ΔN。由于26S蛋白酶体的开放状态，导致HA-FAT10的降解速度加快。(B)实验与(A)相同，只是除了HA-FAT10 Met载体外，还将HA-NUB1L与两种酵母在Leu载体中共转染。在开放状态突变株中，与WT酵母相比，NUB1L对HA-FAT10的降解没有产生加速作用。 FAT10和NUB1L的结合增强了与蛋白酶体亚基RPN1的亲和力 FAT10和NUB1L只能以全长蛋白的形式激活26S蛋白酶体。USP14作为19S调节粒子泛素化蛋白的受体蛋白，可以使26S蛋白酶体的形成开放状态(Peth等，2009)，或者通过与其UBL或USP结构域结合形成开放状态(Aufderheide等，2015；Kim&Goldberg，2018)。为了研究USP14在纯化的26S蛋白酶体制备中的重要性，作者使用LI-COR Odyssey进行了Western blot实验，实验结果使用Image Studio Lite Version 5.5进行定量数据分析。在这些实验中，作者将纯化的26S蛋白酶体单独使用、26S蛋白酶体与NUB1L的共同孵育、26S蛋白酶体与NUB1L和FAT10的共同孵育进行成像分析。 图2。FAT10增加了NUB1L与26S蛋白酶体结合的亲和力。(A)利用LI-COR Odyssey进行Western Blot实验，结果显示出FAT10和NUB1L与26S蛋白酶体的相互作用。NUB1L单独表达或者FAT10和NUB1L一起表达能够干扰USP14与26S蛋白酶体的非共价结合。(B)膜结合His6-RPN1的NUB1L + GST-FAT10(红色)、NUB1L + GST(浅蓝)、NUB1L(深蓝)和GST-FAT10(绿色)的组合曲线。当GST-FAT10与NUB1L结合时，NUB1L与RPN1的结合显著增加，下表中计算的解离常数（Kd）证明了这一点。(C)用GST-NUB1L进行下沉(PD)。左侧FAT10与GST-NUB1L孵育并与多个NUB1L的UBL域竞争，与GFP-Cytb进行融合(命名为NUB1L-UBL-GFP-Cytb)：泳道1，1：0；泳道2，1：1；泳道3，1：2；泳道4，1：4；泳道5，1：8。在1：2的比例下，NUB1L-UBL-GFP-cytb能够与NUB1L结合并取代FAT10-GFP-Cytb。右侧实验条件改变，NUB1L-UBL-GFP-Cytb必须与不断增加的FAT10进行竞争。在这种情况下，1：1的比例足以取代GST-NUB1L中的NUB1L-UBL-GFP-Cytb，两种蛋白都与GST-NUB1L结合。
注意！前方高能！ 文章中采用基于近红外荧光成像检测技术的LI-COR Odyssey进行了Western Blot实验，并使用Image Studio Lite Version 5.2进行分析，有效保证了实验结果的准确性和可重复性！ 准确的检测平台 近红外荧光成像技术，产生稳定的近红外荧光信号，与传统的化学发光相比，信号不受曝光时间、温度等影响，信号与目标蛋白丰度成很好的线性比例关系，因此定量数据更准确、实验重复性更高。 宽动态范围，同一次扫描可同时成像高丰度和低丰度蛋白质，不同梯度条件下，采集弱信号的同时避免强信号饱和。 在不同的凝胶/膜上比较目标蛋白的表达丰度高低，容易引入误差和变量。该平台能够在一张膜上同时检测多种蛋白，无需Stripping 和Reprobing，能更好地满足期刊杂志对检测多种蛋白数据发表的要求。 同时成像目标蛋白和总蛋白（均一化策略） 集成化分析软件Empiria StudioTM 软件具有强大的验证、分析、报告功能，完美的满足了期刊杂志对高质量数据（从原始图像获取到重复性分析）的所有的要求。支持导入图片后自动完成分析并且操作流程简单，减少了不同操作人员之间的误差以确保获得准确的分析结果。几分钟之内即可完成常规分析方法60-120分钟的工作量。 LI-COR Biosciences公司作为近红外荧光成像的创始者，在近红外荧光成像领域已有几十年的积淀。由于LI-COR Odyssey近红外荧光成像系统可实现Western Blot精确定量，多重Western Blot检测，且重复性更高，通量更高，拥有丰富的应用范围，因而得到了全球生物医学研究人员的信赖。 可实现丰富的应用
基因有限公司作为LI-COR产品中国区代理商，为您提供专业的近红外荧光成像技术在Western Blot、In/On-Cell Western、双色EMSA、活体成像等方面的解决方案，提供更多应用咨询及技术支持。进一步了解更多详细内容，请关注我们的官方微信“基因快讯”或联系您身边的基因有限公司工作人员。
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