技术交流
扫描二维码
或添加“GeneGroup003”
获取更多更新资讯
商城订购
扫描二维码
或添加“基因商城（GeneMart）”
手机下单，快人一步
售后服务
扫描二维码
或添加“GeneGroup005”
获取更快速售后支持
MERFISH揭示PD-1治疗有响应的肺癌患者免疫中心图谱
肺癌是全球范围内的致命癌症，但不同患者之间存在显著的异质性。为了更好地理解这种异质性，关注肺癌组织中免疫细胞的分布与活动，以期能够揭示潜在的治疗靶点和生物标志物。来自美国麻省总医院的Jonathan H. Chen研究团队发现了存在于肿瘤组织中的干细胞样免疫中心（stem-immunity hub），并借助MERFISH技术进一步揭示了干细胞样免疫中心内的基因表达、细胞组成和细胞间相互作用。研究结果阐明了人类肿瘤内免疫反应的空间组织及其与患者免疫治疗结果的相关性。为进一步解决肺癌问题打下了坚实的基础。
MERFISH(Multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization)即多重荧光原位杂交技术，突破了传统的smFISH一次检测3-5种基因的局限，通过组合标记、超高分辨率顺序成像，可同时检测多至1000种基因和10种蛋白的表达和空间定位，得出组织全景图片、细胞图片、检测到的所有转录本、显示每个转录本在细胞中的空间分布并对其定量，实现真正意义上的单细胞原位空间转录组研究，是单细胞测序技术不可或缺的验证手段，同时更加擅长检测到低表达丰度的转录本、发现新的细胞亚型、揭示微环境等。MERFISH技术诞生于美国哈佛大学庄小威院士实验室，在空间转录组研究领域是不可或缺的研究手段。
案
例
尽管已有研究表明成熟的免疫细胞区域(Immunity Hubs)富集了TCF7+PD-1+干细胞样CD8 T细胞群体，与肿瘤特异性效应CD8 T细胞的活化和PD-1阻断治疗之间存在积极关联，但是对于免疫细胞在肿瘤内部的确切组织结构以及与其他细胞的相互作用，目前的了解仍然不够深入和全面。因此Spatial analysis of human lung cancer reveals organized 1 immune hubs enriched for stem-like CD8 T cells and associated with immunotherapy response一文，借助MERFISH技术，就参与抗肿瘤的多细胞免疫网展开研究。
一、定义干细胞样免疫中心
研究人员首先使用了RNA ISH/IF技术，对肿瘤内免疫中心进行成像（免疫中心定义为 CXCL10/11+ 细胞周围的邻域）(图1A）。在68个样本中识别出3777个免疫中心。发现响应PD-1阻断疗法病人的免疫中心的中位数频率相对于无响应者增加了5.5倍（图1B）。同时，免疫中心的CD8 T细胞密度比整体肿瘤组织要高（图1C），包括 CD8+ T 细胞亚型，例如激活的 CD8+PD-1+细胞和干细胞样 CD8+TCF7+PD -1+ 细胞（图1C）。这些数据表明，免疫中心与对 PD-1 阻断响应相关，并且是 CD8 T 细胞发挥活性的潜在焦点。
图1.肺癌患者肿瘤免疫中心及PD-1阻断疗法相应关系。(A)多重RNA ISH/IFpanel染色的肿瘤切片(患者43)的图像显示了CXCL10/11的局部表达模式(红色). (B)响应PD-1阻断疗法患者与无响应者的免疫中心面积占肿瘤总面积的比例。(C)细胞表型密度与总评估区域的配对比较，按应答状态着色。每一对由彩色线条连接的点代表一个病人。黑色水平线表示中值和95%的可信区间。
紧接着，研究人员对2712个免疫中心进行了聚类分析，得到了7个亚类（图2A）。其中，响应PD-1阻断疗法患者的亚类3面积占总面积的比例显著升高（图2B-D）。在亚类3中，干细胞样 CD8+TCF7+PD-1+ 细胞种类也远多于其他亚类（图2G），而肿瘤外D8+TCF7+PD-1+ 细胞的密度更低。同时，存活率与此密切相关（图2E-F）。对亚类3进行分析，发现TCF7+细胞密集聚集（包括 CD8+TCF7+PD-1+ 细胞，图2H）。亚类3中干细胞样的CD8+TCF7+PD-1+细胞与IFNG+细胞的频率较高，并与免疫疗法的良好反应密切相关。这表明亚类3在肿瘤内部具有特定的细胞组成，形成了一种独特的免疫反应中心。因此，该亚类被称为“干细胞样免疫中心”。
图2.含有IFNG+细胞和CD8+Tcf7+PD1+T细胞的免疫中心亚类及其与PD-1阻断反应的关系。(A)免疫中心的7个亚类。TSNE图上的每个点代表一个免疫中心。(B)按患者划分的亚类组成，按每个亚类中肿瘤面积的比例绘制。(C)通过比较对PD-1阻断响应者和无响应者，为每个亚类计算平均秩差和相关的BH。(D) 对PD-1阻断响应者免疫中心亚类3更多。(E-F)经Kaplan-Meier分析，免疫免疫中心亚类3与增加的无进展生存率(PFS；E)和总生存率(OS；F)有关。(G)所示表型的亚类免疫中心组成。(H)来自PD-1阻断响应者(患者28号)的组织空间地图。
二、独特的干细胞样免疫中心
由于亚类3中TCF7+细胞丰度很高，研究人员需要确认两点：首先，干细胞样免疫中心与PD-1阻断反应的相关性是否来源于高密度的TCF7+细胞。其次，干细胞样免疫中心与富含TCF7+细胞的三级淋巴结构（TLS）是否存在差异。通过数据分析发现，TCF7+细胞丰度与PD-1阻断反应的相关性较弱（图3A）。同时，由于缺乏B细胞滤泡，干细胞样免疫中心与TLS存在显著差异(图3B)。干细胞样免疫中心表达CXCL10/1+的同时也表达CCL19/22+，说明其具有两大主要趋化因子通路（CXCR3和CCR7配体）。它们吸引了多种类型的免疫细胞，并可能有助于形成对抗肿瘤的复杂免疫反应。其次，这些中心显示出IFNγ诱导基因的高表达水平，包括CXCL9、CXCL10 和 CXCL11 等趋化因子，这些因子与 PD-1 阻断治疗的疗效相关 。
图3.免疫中枢亚类3与Tcf7+聚集体重叠。(A)按响应状态绘制的TCF7+聚合面积(作为所有面积的一部分)。(B) 双箭头表示CCL19+细胞。箭头表示CCL22+细胞。
三、干细胞样免疫中心的组织奥秘
研究人员借助Merscope（Vizgen公司基于MERFISH的商业化平台），设计了479个基因的panel，对肺癌组织进行了基于MERFISH的空间转录组学分析（图4A）。聚类分析结果显示，肿瘤组织被分成了14个“片区（tile cluster）”(将组织分成69097个单个面积为2500um2的小块（tile）)。这14个片区包括干细胞样免疫中心、非干细胞样免疫中心、血管中心和其它被定义为“肿瘤”的区域。相对于肿瘤，干细胞样免疫中心确实富含T细胞趋化因子，包括 CCL19、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CCL17、CCL22、CCL5 （图4B）。与肿瘤组织相比，干细胞样免疫中心中 IL15 和 IL12B 的表达增加，这两者都可能支持T细胞的存活和分化（图4B），通过MERFISH明确了干细胞样免疫中心的趋化因子和细胞因子与其它组织的差异。
研究人员探究了干细胞样免疫中心和非干细胞样免疫中心的细胞类型组成，以确定参与免疫活动的相关多细胞网络。研究人员在四个样本中鉴定了1,488,870个细胞（图4C），平均每个细胞包含转录本的中位数为 36 ，基因数为24，注释为 7 个谱系，分布在4个主要片区中。为了更好地解析免疫细胞组成，研究人员对淋巴细胞和髓系细胞进行了细粒度聚类（图4C）（1. LAMP3+CCL19+ mreg DC, 2. LAMP3+CD1C+ DC, 3. FLT3+ DC, 4. CD1C+ITGAX+ DC,5. FCN1+LYZ+ myeloid, 6. CXCL10+ macrophage, 7. MARCO+ macrophage, 8. FOLR2+CD14+ macrophage, 9. MERTK+macrophage, 10. MMP1+SOX4+ myeloid, 11. PLA2G7+CCL18+ macrophage, 12. SPP1+ macrophage, 13.NCAM1+S100B+SEPP1+ myeloid, 14. B cells, 15. CD4 T cells, 16. TCF7+ CD8 T cells, 17. Treg, 18. CXCL13+ CD4 T cells, 19.CD8 T cells, 20. CXCL13+ CD8 T cells, 21. Tgd/innate-like, and 22. NK.）。干细胞样免疫中心富集了 TCF7+ CD8 T 细胞（图4D-E），以及 CD8 和 CD4 T细胞（图4D-E）。在髓系细胞中，活化的“mreg”DC 富集，其向T细胞呈递抗原（图4D-E）。mregDC群体表达CCL19、CCL17、CCL22、IL15、IL12B 和 IDO1（图4F）。MERFISH技术帮助研究人员了解了干细胞样免疫中心的细胞类型组成，发现其与与肿瘤细胞相对分离，同时能够通过 IL15 等分子支持 T 细胞。
图4.基于MERFISH的免疫中心内淋巴细胞和髓系细胞的空间图谱。(A) MERFISH分析示意图。(B)标记基因(左)、趋化因子(中)和其他分泌因子(右)的指示基因在指示的片区中的表达。(C)来自MERFISH数据的粗细胞型UMAP(上)和细粒度聚类的免疫细胞(下)的UMAP。每个点代表一个细胞。(D)在干细胞样免疫中心(上)和肿瘤(下)内的细胞类型的频率。每一栏代表指定的患者。(E)Log2 odds ratio(OR)：干细胞样免疫与肿瘤(x轴)或非干细胞免疫与肿瘤(y轴)中心内指定细胞种群丰度的丰富程度。(F)在干细胞样免疫中心内的细胞中基因表达。
为了更好地了解干细胞样免疫中心中的细胞间相互作用，研究人员探索了哪些细胞与 CCL19+ mreg DC 和 CXCL10+ 巨噬细胞共定位，因为这些细胞产生定义干细胞样免疫中心的趋化因子。结果发现，mreg DC最常与传统CD4 T细胞和Tregs（图5A-B）相邻。这些数据表明，干细胞样免疫中心可能是激活 CD4 T 细胞（作为细胞毒性效应子）的位点，或者是辅助T细胞或Tregs的激活位点。CXCL10+巨噬细胞优先与干细胞样免疫中心内外的CD8 T细胞相互作用（图5A-B）。最近的研究表明，这些巨噬细胞可能会促进CD8 T细胞耗竭。MERFISH技术帮助研究人员发现了干细胞样免疫中心包含髓系-T细胞相互作用的两个轴，即mreg DC与CD4 T细胞和CXCL10+巨噬细胞与CD8 T细胞（图5C）。
图5.干细胞样免疫中心内的细胞-细胞相互作用。(A)对干细胞免疫中心内的细胞进行邻近细胞分析。(B)直方图上的红线显示了在患者38的干细胞样免疫中心内观察到特定的T细胞类型与指定的髓系细胞类型相邻的频率。(C)干细胞样免疫中心内示意图。
2021年，Vizgen率先将整合了MERFISH与超分辨率成像技术的分析系统MERSCOPE™推向市场。基于核心技术MERFISH技术，MERSCOPE™可在1天内对1cm²的组织进行超分辨成像，分辨率100nm，定位单细胞中RNA的空间分布以及定量基因表达。实现真正意义上的原位单细胞空间转录组分析，让基因的表达和定位可视化，推动基因组学的研究步入下一代。
基因有限公司于2022年3月正式签约成为美国Vizgen公司MERSCOPE™超分辨显微成像分析系统在中国区的合作伙伴。负责该仪器的售前技术咨询、售后安装培训、应用支持等工作。同时，上海贝晶生物技术有限公司也提供MERFISH技术服务。 想要了解关于更多有关MERFISH的技术信息，可添加下方微信。
关于基因 基因有限公司成立于1992年，是一家提供生命科学科研仪器、试剂耗材和技术服务的综合服务商。基于“Gene Brightens Every Life • BioTech Connects the World”——“基因燃亮生命 • 生物技术连接世界”的愿景，专注于生命科学领域前沿技术的引进和推广，致力于推动该领域国内科研机构硬件水平及实验方案的革新与升级。同时，公司也一直致力于自主品牌的科研设备的研发与生产，拥有一系列通用性强、互补性高的自主品牌产品。 基因的服务网络遍及全国各地十多个大中城市，拥有包括仪器销售，试剂销售，市场与技术支持，维修，客服，物流等多个部门组成的完整服务体系。 我们希望通过不懈努力，为您的成功铺路搭桥，也为中国的生命科学事业赶超世界先进水平尽一己之力。欲了解更多信息，请访问www.genecompany.cn。
