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难度升级！FFPE样本经染色和激光显微切割后RNA还能提吗？
福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织构成了生物医学研究的巨大样本宝库。然而到目前为止，由于RNA-蛋白交联和RNA断裂使得从FFPE组织中提取RNA十分具有挑战性，这两者也严重影响下游分析的RNA数量和质量。更不用说当样本量有限时，例如为了排除组织异质性的影响，在FFPE染色切片中通过激光显微切割（Laser-capture microdissection，LCM）分离特定细胞亚群，提取其中的RNA用于反转录定量PCR (RT-qPCR)或下一代测序(NGS)分析。因此对于这种易降解、难处理且微量的样本，如何有效提取其中的RNA成为了方法学上需要突破的一个难题。 我们来看看自于苏黎世大学的研究者发表在BMC Molecular Biology上的一篇Methodology Article，他们早在2017年就开始致力于从LCM富集的FFPE组织中提取RNA的方法学优化。 该研究中使用LCM获取临床FFPE犬乳腺肿瘤标本癌症相关间质(CAS)和正常间质组织，并将常用的基于蛋白酶的RNA提取程序与Covaris truXTRAC提取的新技术进行比较。
研究中选取了13例犬乳腺癌FFPE样本，切片厚度10 μm，为了更好地挑选目标切割区域，对组织切片进行Cresyl Fast Violet染色 ，分别切割并收集正常癌旁间质组织和CAS，收集的样本分别采用基于蛋白酶的活性的纯试剂处理提取和利用Covaris AFA聚焦超声的方法提取，尽量保证两种提取方法所用的LCM样本面积大小一致，多方位比较两种方法提取的效果。
通过LCM从FFPE样本的正常和CAS中分离和分析RNA的工作流程 两种RNA提取方法的工作流程 "Old"(protease‑based)基于蛋白酶的FFPE RNA提取 显微切割后的样本立即使用FFPE全核酸分离试剂盒提取mRNA，为了避免二甲苯对RNA的破坏，跳过二甲苯和100%乙醇脱腊步骤，将切除的组织直接浸入含有100 μl消化缓冲液和4 μl蛋白酶的0.5 ml离心管中。根据制造商“优化提取和定量FFPE样品中的RNA用于基因表达分析”的protocol，样品需要50°C加热 3小时，然后70°C加热20分钟用于组织消化和解交联。 "New"(sonication‑based)基于超声的FFPE RNA提取 显微切割下来的组织转移到聚焦超声专用的玻璃管中，使用Covaris E220 AFA 聚焦超声仪对样品处理5min，使用Covaris®truXTRAC FFPE RNA试剂盒进行RNA提取。50°C消化15min、80°C解交联60min后，将可溶性部分转移到干净吸附柱中进行DNase I处理并离心。用预热至70℃的30 μl的洗脱缓冲液首次洗脱RNA，再用20-30 μl的预热洗脱缓冲液，第二次洗脱，两次洗脱液分别收集，-80℃保存。
从以上操作步骤上对比，两种方法都需要经过组织消化和解交联步骤，不同的是经过AFA超声处理后的样品更易消化与解交联，能将样品处理速度加快2个小时。那这两种方法提取出来的RNA丰度与质量如何呢？
所有样本中提取的 RNA 得率和 RIN（RIN: RNA integrity number，RNA完整性参数) 值列表 n.d. = not detectable.
从上图看出，无论是正常组织还是癌症组织，基于超声处理的新方法相较于旧方法的RNA得率显著增加，RNA完整性数值基本一致。 新方法中采用二次洗脱使RNA得率相较于单次洗脱平均提高了32.2%，结合两次洗脱的RNA量，相较于传统基于蛋白酶活性的方法，Covaris truXTRAC方法在正常癌旁组织中RNA得率增加了8.2倍，在CAS组织中提取的RNA增加了12.8倍。 RT-qPCR验证 为了对提取的RNA质量进行进一步验证，作者进行了RT-qPCR实验，使用上述所得的10ul RNA进行反转录，取2.5ul cDNA作为RT-qPCR模板，检测两个看家基因GAPDH和B2M，通过比较Cq值，发现使用Covaris truXTRAC新方法分离的RNA在RT-qPCR中的平均Cq值比使用旧方法提取的RNA的平均Cq值低，使用新方法提取的RNA在GAPDH引物中平均Cq值低2.06个循环，在B2M引物中平均Cq值低2.59个循环。 用truXTRAC新方法和旧方法提取的RNA进行RT-qPCR，得到两个看家基因GAPDH(蓝色)和B2M(灰色)的∆Cq值柱状图。负值表示truXTRAC方法比经典方法性能更好。 新旧方法RT-qPCR所得的平均Cq值以及∆Cq值列表 NGS验证 作者使用RNA-seq比较从两种方法中提取的RNA的性能，检查了所有生成reads的总体映射率。两种方案都有49.45-79.51%的reads可与犬参考基因组对应。两种方案间无系统差异(p = 0.5936)。此外，作者还研究了基因组外显子区域的信息，两种方案映射到外显子区域的reads比例在14%到17.07%之间，但新方案提取的RNA映射到外显子区的reads平均增加了1.55% (p = 0.0323)。最后，检查基因覆盖率以确定表达基因3'或5'端的偏差(FPKM > 10)，发现二者文库的覆盖度都呈现较均一的状态。 两种方法提取的RNA测序后的reads覆盖度 两种提取方法提取的RNA测序reads数目覆盖的外显子、内含子和其他区域的比例 两种提取方法提取的RNA测序后对中等长度基因（400-1000nt）的全长覆盖度
作者指出使用经典方法提取RNA的瓶颈主要来自蛋白酶K的效率低下，尽管尝试延长消化时间，仍然不能完全消化LCM分离的CAS和正常基质中的纤维组织，有肉眼可见的组织块不会溶解，这其中仍然含有大量的RNA，导致总RNA产量低。作为Covaris truXTRAC工作流程的一部分，Covaris聚焦超声仪提供的声学AFA能量能充分地破碎组织，使蛋白酶K对FFPE组织的可及性提高，允许更多的FFPE组织被蛋白酶K均匀地消化。并增加了与RNA和其他分子交联的解离，使RNA更容易被分离。 进AFA处理后无肉眼可见的组织片（紫色） 总之以上研究成功地采用了一种方案，使用Covaris AFA聚焦超声从轻微脱蜡并染色的临床LCM样品中分离RNA。这对于研究存档FFPE组织中的特定部位基因表达特征提供了可能性，解锁了迄今为止难以分析的样本的新维度。 参考文献： Amini, P., Ettlin, J., Opitz, L. et al. An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing. BMC Molecular Biol 18, 22 (2017). https://doi.org/10.1186/s12867-017-0099-7
Covaris Covaris公司一直致力于研发基于声学、机械及分子生物学的高性能组织样本处理系统，专注于样本前处理。为FFPE样本的核酸和蛋白提取开发了一站式解决方案，帮助科研工作者在不使用二甲苯的健康工作流程中，采用AFA聚焦超声充分脱蜡和破碎组织，快速、稳定、高效地获得生物大分子。
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