基于shotgun测序的非培养技术已广泛应用于微生物学领域，使得从复杂的环境微生物组中直接恢复个体基因组成为可能，极大地提高了研究人员对难分离或培养微生物的功能和进化的认识。

虽然Illumina测序因高通量是宏基因组研究中应用最广泛的方法，但是在对环境样本进行从头组装时，短读长往往无法正确组装包含较长重复元件的基因组序列，使得基因组组装碎片化的问题被放大，特别是当微生物群落中含有未知丰度的高度相关的物种时。

而PacBio HiFi测序以其10-25 kb的长读长和Q30的高准确性提供了一种可能的解决方案，可以更好地解决模棱两可的重复区域，生成高度完整的基因组。

红树林湿地是具有重要生态特征的滨海生态系统，为多种微生物提供栖息地，在营养和生物地球化学循环中起着关键作用。然而由于Illumina短读长的局限性，红树林沉积物中的微生物多样性在很大程度上仍未被发现。

为此，深圳大学高等研究院李猛团队在《Microbiome》发表了题为“Long-Read Assembled Metagenomic Approaches Improve Our Understanding on Metabolic Potentials of Microbial Community in Mangrove Sediments”的研究论文，基于Illumina短读长测序、PacBio HiFi测序以及二者的组合(Hybrid assembly)进行了宏基因组测序，研究了红树林沉积物中的微生物群落和代谢潜力(图1)。与单独的Illumina组装相比，PacBio HiFi测序显著提高了序列连续度、减少了contig数量、并产生代表新分类群的新MAG（Candidatus Cosmopoliota），为深入了解红树林沉积物的微生物和代谢特征提供了基础。

本研究采用Illumina HiSeq (PE150)和PacBio SMRT测序平台对红树林沉积物微生物组进行了深度shotgun宏基因组测序。共获得Illumina短读长数据约210.9 Gb, PacBio HiFi测序约51.5 Gb 。

1 PacBio测序极大地改善了宏基因组的组装和分类

比较三种组装策略（Illumina组装、PacBio HiFi组装和Illumina-PacBio HiFi Hybrid组装）的结果(图1)：

（1）PacBio HiFi组装产生的contigs数量最少(48,406)且最长（最长6 219.7 Kb，平均547.4 kb），Illumina组装产生的contigs数量最多(3,384,302)且最短（最长357.1 Kb，平均63.3 kb）；

（2）PacBio HiFi组装的N50最长（629.775 kb，平均364.6 kb），Illumina平均N50值为18.2 kb，Hybrid平均N50值为47.2 kb；

（3）PacBio HiFi组装的MAGs连续性更好，由1-140个contigs组成(平均31.7)，显著低于Illumina MAGs(3-2,764个contigs，平均239.4)和Hybrid MAGs(7-3,636个contigs，平均564.5)。

（4）有PacBio HiFi参与组装的MAGs的质量更高：研究人员分别从Illumina、PacBio HiFi和Hybrid组装中重构了766、773和1451个MAGs，其中分别有28、28和47个是高质量的基因组草图(完整性≥ 90%，污染< 5%)。继续评估中等质量(完整性≥ 50%，污染< 10%)的原核MAGs，发现从所有组装的宏基因组中共获得了562个中等质量的原核MAGs，有260个来自Illumina组装(48个Illumina特异性)，203个来自PacBio HiFi组装(133个PacBio HiFi特异性)，377个来自Hybrid组装(189个Hybrid特异性)。

（5）MAGs组装一致性：基于两个关键指标——平均氨基酸同一性(average amino acid Identity, AAI, > 99.5%)以及基因组和基因的共线性，分析发现Hybrid和PacBio HiFi组装的12个具有代表性的高质量MAGs与Illumina组装的MAGs具有较高的一致性。

综上，结果表明PacBio HiFi测序组装的基因组连续性更好(contigs数目更少，contig N50更长)，并且可以大大提高获得的基因组数量(1.16倍)，特别是高质量基因组(1.21倍)。

2 重构MAG的质量和多样性

在562份中等质量以上的原核MAGs中，有280份完整度> 70%，186份完整度> 80%，97份完整度> 90%，64份完整度≥90%且污染< 5%（高质量MAG）。例如，隶属于热变形菌门（Thermoproteota）和河床菌门（Zixibacteria）的2个MAGs完整性为100%，污染度较低(分别为1.61%和1.1%)。此外，还有4个MAGs只由一个contig组成，其中3个没有污染(0%污染)，有1个（即Bin.433）几乎组装完整(完整性95.7%)。本研究重构的MAGs中只有12个MAGs在其他研究中报道过，其余550个是新重构的MAGs 。

对562个MAGs进行分类分析(图2)发现，重构的MAGs涵盖了39个细菌门(455个MAGs)和12个古细菌门(107个MAGs)，其中大多数没有可培养的细菌代表。细菌的MAGs主要由变形菌门(95个MAGs)、绿弯菌门(80个MAGs)和脱硫菌门(78个MAGs)的γ-变形菌纲(84个MAGs)、厌氧绳菌纲(53个MAGs)和脱硫菌纲(45个MAGs)代表，而古细菌的MAGs主要由广古菌门(27个MAGs)、深古菌门(24个MAGs)和阿斯加德古菌(15个MAGs)代表(图2)。

3 微生物群落的代谢潜力

相比于红树林沉积物微生物群落中原核生物的基因组的组装，真核生物基因组的组装仍然是主要的计算挑战之一。所以此前的研究大多聚焦在原核生物的生物多样性，对红树林沉积物中真菌群落的代谢功能缺乏详细的研究。一是因为复杂群落的二倍体或多倍体性质和长重复序列的存在，二是因为真核生物在红树林沉积物微生物群落中所占比例相对较低(低至9%)。因此，本研究利用Illumina-PacBio HiFi Hybrid组合测序数据可以用更少的contig数和更长的contig来探索真核生物群落的基因和代谢潜力。通过注释，共分出33,800个真核生物的contigs，约为163 Mb，其中最长约为199 kb，平均长度约为5 kb。研究人员利用562个中高质量的原核生物MAG和9,710个组装的真菌contigs初步探索了红树林沉积物中微生物群落的碳、氮和硫相关代谢潜力。

经过代谢重建，研究人员发现红树林沉积物中的原核生物在氮和硫循环中发挥了关键作用，具有降解有机碳、发酵、自养和固碳的多种能力。红树林真菌在其中具有广泛的代谢潜力，可以降解各种碳水化合物和肽底物，并可能参与有机碳、氮和硫循环(图3)。

值得注意的是，根据系统发育和系统基因组分析，提出了一个细菌新门——Candidatus Cosmopoliota，该类群细菌在全球广泛分布，具有多样化的生活方式，能利用多种有机物，具有厌氧发酵和碳固定（Wood-Ljungdahl（WL）途径和rTCA循环）的能力(图4)。

该研究不仅展示了PacBio HiFi测序在宏基因组分析中的应用潜力，同时进一步解析了对红树林湿地不同类群微生物代谢结构和生态功能的认识。

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PacBio HiFi测序系统

HiFi测序读长能达到10-25 kb，准确度也在Q30（99.9%）以上，在微生物研究上表现优异，主要具有以下显著优势：

• 全长16S测序，对菌种有更高的分辨率，能识别到更多的属和种；还有包含16S+ITS+23S区域的StrainID试剂盒，全长2.5 kb，甚至可以达到菌株级别的分辨率；

• Shotgun profiling不经过组装，能够进行更全面、精细的物种分辨，识别到种甚至菌株水平，无偏好性，能提供比短读长更多、更丰富的功能信息；

• Shotgun assembly能组装更多、更完整、拥有更高质量的MAGs，即使在较低的覆盖范围，也可以获得单个或者成环的MAG来帮助您解析一些难以培养或分离的微生物基因组。

综上，HiFi测序不仅能提供更全面的微生物基因组视图，还能极大提升样本覆盖度和多样性，在微生物群落基因组的分类和组装上的表现都更加优异。

基因有限公司

基因有限公司作为PacBio公司的中国区代理商，自2011年以来将PacBio第三代单分子实时测序技术引入国内，一直为国内用户提供专业的三代测序系统的安装培训，技术支持，应用培训与售后维护工作，赢得客户的一致好评与信任。基因有限公司将一如既往的支持越来越多的PacBio用户。