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突破NGS局限，看HiFi测序如何将微生物群落属种株一网打尽
背景介绍
在微生物学研究中，特别是对于微生物群落结构和多样性的研究，16S rRNA测序是分析微生物种类及组成的关键方法。16S rRNA是一个高度保守的基因片段，在不同的微生物中存在，并且在进化过程中变化相对较慢。这使得16S rRNA成为了研究微生物分类学和进化关系的有用工具。
使用NGS测序平台进行16S rRNA测序时，由于其读长短的限制，通常只测序16S rRNA的特定区域，而不是整个基因的全长序列。常见的16S rRNA的测序区域包括V1-V2、V3-V4和V4-V5等。基于这种方式的测序结果会导致对群落中微生物种类的鉴定只能到“属”，无法达到更精准的“种”，甚至是“株”。同时，对16S rRNA测序区域的选择（需要考虑多种因素，如变异率、覆盖度等。不同区域可能适用于不同类型的微生物群落，需要权衡），也会影响到微生物种类鉴定。
如何破局
由于NGS平台读长较短的特点，限制了部分其在16S rRNA测序中的表现，16S rRNA的全长测序凭借其优点强势崛起。
以PacBio HiFi测序为代表的三代测序技术，突破了二代测序GC偏好性及短读长的限制，HiFi reads（High Fidelity reads）基于环形一致性测序（Circular Consensus Sequencing，CCS）模式，产生出既有较长的读长（最长可达25kb的长度），又具有较高的序列精度（约99.9%准确率）的测序结果。基于PacBio平台的16S rRNA测序通过其长读长优势，能够覆盖整个16S rRNA基因，包括高变异性的区域，从而为物种鉴定和分类提供更准确和全面的数据，为16S rRNA测序带来了全新的可能性：
1.更准确的分类和物种鉴定：16S rRNA基因是微生物中高度保守的序列，其不同区域的变异性可以用于区分不同的微生物物种。全长序列测序能够提供更多的信息，使得物种的鉴定更加精细准确。
2.更完整的群落结构分析：全长16S rRNA测序可以更准确地区分微生物，同时提供不同种类丰度信息，从而更好地描述群落的组成和结构。
3.解决结构变异：一些微生物具有16S rRNA基因中的结构变异，这导致传统的短读长测序技术难以完整地覆盖。PacBio的长读长有助于解决这些结构变异，从而提供更全面的序列信息。
4.避免偏好性：使用16S rRNA全长序列测序，可以避免基于NGS平台使用不同引物进行片段扩增时产生的偏好性，从而更全面地了解微生物群落的组成。
5.进一步的生物多样性研究：全长序列测序可以提供更多的序列信息，这对于研究微生物的进化、系统发育以及遗传多样性等方面更有价值。
该文通过应用长读长测序技术和短读长测序技术对青藏高原盐湖沉积物样品进行测序，评估了不同组装策略在宏基因组组装和病毒组装中的性能。28.9% 的 NGS 读取可以分配到已知的分类等级，而HiFi数据的读取分配率为90.8%，大约是NGS的三倍。HiFi reads的物种级别分配率为67.19%，而短读长的相应比率仅为5.59%，说明HiFi reads在分类方面的强大能力。总共鉴定出17个最小相对丰度大于0.1%的门，大大超过了NGS技术的检索性能。这为复杂环境样品的物种组成研究，特别是对真核微生物的了解提供了便利。
图1.基于HiFi reads的分类分辨率。(A) HiFi和NGS读数具有(已知)/不具有(未知)分类信息的百分比。(B和C)基于19个全长18S-OTUs (B)和207个全长16S-OTUs (C)的系统进化树。
这篇文章通过使用全长16S rRNA基因测序和
amplicon sequence variant (ASV)分析方法（ASV是一种基于序列变异的方法，可以更准确地鉴定和计数细菌的种类和丰度，相比传统的OTU分析方法具有更高的分辨率和准确性）来确定每个样本的细菌组成。对144对唾液和粪便样本进行了检测，验证了口腔细菌向肠道的转位，并发现口腔细菌在肠道中的丰度与年龄和牙菌斑积累有关。
图2.唾液和肠道微生物群组成的比较。(A)基于扩增子序列变异丰度的Bray-Curtis距离对唾液和粪便样本的主坐标分析图。唾液和粪便样本的细菌组成用不同的颜色表示。虚线的交点表示每组的重心。椭圆覆盖了属于每组的67%的样本。(B)优势属的平均相对丰度。根据系统发育树对唾液或肠道微生物群中平均相对丰度≥1%的24个属进行排序。每个属的平均相对丰度由颜色强度表示。(C)每个受试者配对的唾液和粪便样本之间的Bray-Curtis距离直方图。
该研究通过对中国珠江口河口的盐度梯度沿线进行的宏基因组测序和全长16S rRNA测序，全面分析了浮游细菌群落、抗生素抗性基因（ARGs）、移动遗传元件（MGEs）和细菌毒力因子（VFs）的丰度和分布。研究发现，随着盐度的增加，蓝藻取代了变形菌门成为主要细菌。淡水区域的ARGs、MGEs和VFs显示出最高的多样性和丰度。水平基因转移是ARGs通过MGEs进行细菌间传播的主要途径。潜在致病菌携带大量ARGs。研究还发现环境因素如盐度和营养浓度对细菌群落结构和分布具有显著影响。
图3.随着盐度的增加，蓝藻取代变形菌成为优势菌。淡水地区ARGs、MGEs和VFs的多样性和丰度最高。
基因有限公司作为PacBio公司在中国区代理商，自2011年以来将PacBio第三代单分子实时测序技术引入国内，一直为国内用户提供专业的三代测序系统的安装培训，技术支持，应用培训与售后维护工作，赢得客户的一致好评与信任。基因有限公司将一如既往的支持越来越多的PacBio用户。
