Sanger测序作为基因检测的金标准，是NGS测序结果验证的主要方式。那么，怎样利用Sanger测序来验证NGS测序的结果呢？

Sanger测序技术：测序前先进行PCR反应，将需要测序的目的片段进行扩增，从而使目的片段量达到绝对值，使信号放大。接着纯化PCR产物，用带有标记的双脱氧核糖核苷酸（ddNTP）再进行PCR，这时ddNTP会随机地加入到正在合成中的DNA片段里，得到长度不同的、带有不同荧光标记的片段。然后得到的PCR反应产物通过毛细管电泳分离、荧光信号记录即可完成检测。

基于DS3000可完成NGS数据中单碱基替换、插入和缺失的验证：

单碱基替换

从人类结肠癌细胞株(HCT116)的NGS检测结果中随机选取了12个单碱基替换作为此次验证的对象(表1)。首先，结果表明不论是纯合还是杂合的单碱基替换，DS3000碱基识别程序都在特定部位上的正确识别了单个峰（纯合）或两种峰（杂合）的重叠(表1)。值得注意的是，对于杂合突变的识别，更加需要正确识别两种峰，因此需要更高的仪器可靠性。

图1表示在DS3000中获取的波形数据的示例(表1，ID:9)。如NGS分析所示，DS3000正确识别了胞嘧啶与胸腺嘧啶的峰以及混合碱基(Y)(图1A)。

表1. 单碱基替换的分析结果

图1.MYCBP2(表1，ID:9)中识别出的杂合单碱基替换的波形数据。

然后，用Mutation Surveyor进一步对杂合突变率进行了定量。突变率分布在大概50%为中心的地方(图2)。而且DS3000的两种测序模式——快速模式和标准模式在定量结果上没有显著的差异。

快速模式：run time = ~30 min, read length with quality > ~600 bp；

标准模式：run time = ~60 min, read length with quality > ~700 bp。

图2.用DS3000与Mutation Surveyor进行突变率的定量。fast：快速模式；std：标准模式。

碱基插入、缺失

存在于细胞核内的等位基因组中的一个发生碱基插入或缺失时，由于两种不同碱基峰的波形重叠在一起，突变等位基因的识别会变得困难(图3)。在NGS数据中，CTNNB1中存在胞嘧啶-胸腺嘧啶-胸腺嘧啶(CTT)的缺失，PLA2G15中存在鸟嘌呤(G)的插入(表2)。从图3可知，通过结合使用DS3000的波形数据与Mutation Surveyor软件，可以正确地检测出各个碱基的插入或缺失。

图3.表示碱基的插入与缺失的突变等位基因的分析结果。A-B：CTNNB1的CTT缺失；C：PLA2G15的G插入。

表2. 碱基插入/缺失的分析结果

结论

在此验证中DS3000检测出了选取的所有NGS中的突变。此外，通过与Mutation Surveyor结合使用，可以进行突变率的定量，并且可以识别出碱基的插入与缺失。

注：仅限科研使用，不可用于医疗诊断及其相关用途。本资料中刊登的数据仅为测试示例，不确保数据的准确性。

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