短读长的RNA-seq已经被应用接近了20年，RNA-seq最常被用于分析基因的差异表达，从那时起它已经成为分子生物学中最常用的工具之一，极大的加速了我们对生物学的理解。但至今为止，准确量化和发现RNA可变剪切亚型（isoform）对基于短读长的RNA-seq仍然是一个挑战。

使用 PacBio Iso-Seq 测序方法可以捕获完整的转录亚型，但是因为通量有限，并没有被广泛应用，尤其是在单细胞转录组测序领域。为了解决这个问题，Broad研究所的研究人员开发了MAS-ISO-seq技术，这是一种以编程方式将互补DNA (cDNA)连接成最适合HiFi测序的检测长度的技术，能够将单细胞全长转录组测序通量提高了15倍以上。相关研究于2023年6月8日发表于生物科技领域的权威期刊《自然－生物技术》（Nature Biotechnology）。

为了验证MAS-ISO-seq忠实还原RNA isoform的能力，研究人员对Lexogen SIRV-Set4进行了全长RNA测序。Lexogen SIRV-Set4是一种合成的RNA标准品（包含不同摩尔浓度的69种RNA异构体和4-12k的不同长度）。如下图所示：Smart-seq3异构体组装会有高达43%的错误率，而MAS-ISO-seq可以直接识别isoform，无需生信组装，只有0.4%的错误。

虽然利用短读长测序和HiFi测序得到的测序深度差异很大，细胞聚类和基因表达却高度一致，如下图所示。这说明仅通过HiFi测序就能够独立且稳健地获得细胞聚类结果。

利用T细胞分化过程中CD45的不同剪接模式，研究人员使用CITE-seq在蛋白质水平上对CD45亚型表达进行了正交验证，并将结果与使用MAS-ISO-seq检测的mRNA水平进行了比较。结果显示，这两种模式之间的CD45亚型表达高度一致，如下图所示。

与基于抗体的CITE-seq方法相比，单细胞长读长转录组在解析多种编码CD45亚型（RO、RA、RAB和RBC）方面的能力更加精细。这是因为抗体的单表位特异性限制可能无法区分密切相关的亚型。例如，CD45 RA抗体不能区分CD45 RA和RAB。

基于MAS-ISO-seq方法学，PacBio 现已推出针对单细胞全长转录组测序的建库试剂盒 MAS-seq kit。通过将短的10x Genomics cDNA 进行串联建库的方式连接起来再进行HiFi测序，从而解决了长读长单细胞 RNA 测序的通量瓶颈。

Sequel II/IIe 和 Revio 系统上运行的 PBMC MAS-Seq 文库的 Reads、细胞和转录本统计数据。

为了助力更多科研工作者开启单细胞全长转录组研究，PacBio中国正在对MAS-Seq for 10x Single Cell 3' kit（PN：102-659-600）进行五折限时促销，有效期至2023年06月30日。希望您不要错过此次机会，获取50%折扣的试剂盒的限时特惠价！

参考文献：