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MMI激光显微切割助力寄生虫侵袭神经系统病理机制研究
MMI激光显微切割助力寄生虫侵袭神经系统病理机制研究
德国MMI厂家下的CellCut全自动激光显微切割系统可方便快捷地将不同类型的细胞或组织从样本中分离下来，如神经系统中白质灰质等，从而获得单一类型的同质细胞或组织，使后续在基因组等水平上进行的研究更加精细、准确。其高精度的激光切割性能、“三明治”式的样本处理方法以及高收集效率的管盖分区主动式粘附采集等特点保证了实验结果的高度可靠性和可重复性。
下面我们来了解一下MMI激光显微切割在寄生虫侵袭神经系统的病理机制研究中的应用。
MMI助力寄生虫侵袭神经系统机制研究
寄生蠕虫经常侵入哺乳动物（包括人类）的中枢神经系统 (CNS)。宿主免疫反应影响蠕虫的生长和存活，但也可能参与发病机制或行为改变。因此，需要深入了解宿主-寄生虫免疫相互作用，以开发更好的保护措施、治疗策略和诊断工具。目前，代表血吸虫病或包虫病的神经学形式的有效模型仍然缺乏。因此，需要用于研究蠕虫神经感染的新模型物种来揭示宿主-寄生虫相互作用和（免疫）病理后遗症的多样性。
在这篇22年2月发表在PLOS PATHOGENS上的一篇文章中，研究人员对 Trichobilharzia regenti（血吸虫科）对小鼠脊髓的神经侵袭进行了研究。血吸虫通过小鼠脊髓的主动迁移引起后肢运动缺陷，但不影响一般运动或工作记忆。对受感染脊髓的组织学检查显示嗜酸性粒细胞性脑膜脊髓炎存在，富含嗜酸性粒细胞的浸润物包裹着血吸虫。脊髓的流式细胞术和转录组分析证实了宿主免疫反应的强烈激活。
总的来说，运动改变、神经生理功能显著破坏和强烈的 M2 极化是血吸虫神经侵袭的最显著特征，这也揭示了这种血吸虫侵袭神经的疾病模型在后续研究中的潜力。
研究内容与结果
✦ 血吸虫引发外周免疫反应并侵入中枢神经系统，尤其是脊髓
研究人员使用C57BL/6J 小鼠建立了血吸虫感染模型，对感染后小鼠的存活率、不同时期产生寄生虫特异性 IgG1 和 IgG2a的浓度、血液嗜酸性粒细胞数量等进行了检测。进一步检查了血吸虫在中枢神经系统内的分布，分别对7/14/28 dpi的血吸虫数量和分布位置进行了研究，结果证明了针对血吸虫的外周免疫反应早期激活的存在，该反应证明血吸虫在 7 dpi 时成功侵入中枢神经系统，尤其是脊髓。
C57BL/6J 小鼠中血吸虫感染的一般特征。(A) 与年龄匹配的未感染对照小鼠相比，受感染小鼠的体重增加较低。(B) 在小鼠血清中检测到的血吸虫特异性 IgG1 和 IgG2a 的水平在整个感染过程中稳步上升。Th2 相关 IgG1 优于 Th1 相关 IgG2a，尤其是 28 dpi。(C) 受感染小鼠的血液嗜酸性粒细胞计数在 7-21 dpi 内增加。(D) 在感染小鼠 7-21 dpi 中观察到脾脏肿大。(E) 在中枢神经系统内，7 dpi 发现大多数存活的血吸虫主要位于脊髓。释放的血吸虫数量在以后的时间点显著减少。(F)在 7-21 dpi 的大多数脊髓组织样本中都检测到了 T. regent DNA。
在每张图中，点表示来自个体小鼠的数据。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
✦ 感染导致小鼠运动功能缺陷
研究人员评估了神经侵袭对小鼠行为各个方面的影响，包括穿过桥梁、倒挂网格、穿过迷宫等，在这些活动中观察小鼠的身体行为，比如步幅、尾巴姿势、耐力等。结果表明，运动功能缺陷是血吸虫神经侵袭最明显的行为后遗症。
血吸虫感染对小鼠行为的影响 7 dpi。(A) 在宽梁和窄梁上行走，感染小鼠的运动协调性受损。(B) 网格测试，感染小鼠的前肢和后肢耐力和力量较差。(C) 受感染小鼠前肢和后肢的足迹分析、姿势和步态的改变。(D) 两组的杠铃握持、正常耐力和前肢力量。(E) 两组的开放场地、不受影响的运动活动和焦虑。(F) 新奇引起的吞咽不足，即由于更强的食欲动机而导致吃了更多的燕麦片，而不是感染小鼠的焦虑增加。
在每张图中，点表示来自个体小鼠的数据。展示了 3 个独立实验的汇总数据。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
✦ 富含嗜酸性粒细胞的浸润物被检测到消除了脊髓中的血吸虫，嗜酸性粒细胞是浸润整个中枢神经系统的数量最多的细胞
研究人员对脊髓进行了组织学检查，以阐明受影响最严重的小鼠的感染过程。对血吸虫感染区域周围的嗜酸性粒细胞、单核细胞等细胞种类，以及血吸虫体型特点等进行了观察和检测。采用流式细胞术量化浸润受感染神经组织的免疫细胞，以观察细胞免疫反应的动态。结果表明，血吸虫的神经侵袭引起嗜酸性脑膜脊髓炎，导致中枢神经系统周围白细胞的浸润程度非常高。
血吸虫感染脊髓的组织学检查。(A) 在未感染的脊髓中，没有明显的白细胞浸润。(B) 白质中完整的血吸虫，7 dpi。血吸虫周围没有炎症细胞，但在邻近区域观察到嗜酸性粒细胞外渗（嗜酸性粒细胞用白色箭头标记）。(C) 血吸虫后面的“火箭尾”白细胞簇 14 dpi。嗜酸性粒细胞和单核细胞在簇中占主导地位。(D) 14 dpi 被破坏的血吸虫周围的炎性病变。相邻的软脑膜间隙（灰色星号）增厚且严重发炎。(E) 21 dpi 消退的炎性病变内的血吸虫残余物。(F) 28 dpi 脊髓组织，没有明显的血吸虫残留或炎症灶。比例尺= 50 μm。
血吸虫感染期间小鼠中枢神经系统中主要免疫细胞群的动态。(A–D) 通过流式细胞术分析脊髓 (A)、脑干 (B)、小脑 (C) 和半球 (D) 中的小胶质细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞/单核细胞和淋巴细胞。在所有检查的节段中，在 14 dpi 时观察到嗜酸性粒细胞计数显著增加。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。(E-H) 脊髓 (E)、脑干 (F)、小脑 (G) 和半球 (H) 中所检查的免疫细胞群的相对比例。外周白细胞大量浸润导致小胶质细胞比例明显下降。
MMI显微切割发挥的作用
其中，对血吸虫感染区组织的显微切割是采用德国MMI激光显微切割进行，从感染血吸虫小鼠中提取颈部、胸部和腰部脊髓节段，进行激光显微切割，从中切割分离出血吸虫周围100um范围内的脊髓白质，并随机选取未感染小鼠的适当节段白质作为对照样本。
血吸虫幼虫周围脊髓组织的蛋白质组学分析。(A) 感兴趣区域的示意图。使用MMI激光显微切割系统对距血吸虫 100 μm 以内的区域以及血吸虫消化道进行切割（用星号标记）。(B) 显微镜的真实图像，标记与 (A) 一致，即已经显微切割的区域以红色勾勒出轮廓。比例尺 = 100 μm。
总结
在本文中，研究人员从行为测试到“组学”分析，探索了感染 T. regenti 血吸虫的小鼠中枢神经系统中宿主免疫反应和蠕虫诱导的病理学机制，揭示神经组织内宿主与寄生虫相互作用的多样性。研究人员提出了一项关于血吸虫侵入小鼠脊髓的全面的、转录组驱动的研究。由于与人类神经病原体在寄生虫学、免疫学或病理学上的相似性，T. regenti 血吸虫代表了进一步研究神经感染的合适模型。
MMI激光显微切割系统特点
“三明治”式样品制备
“三明治”式样本处理方式使样本被保护在玻片与膜之间，在样品转移及切割过程中免受污染和损伤。
Step 1.将待切割样本按常规样本准备方式，铺在膜片上（图1~2）
Step 2.将膜片放于玻片上，形成“三明治”结构，样本被保护在载玻片和薄膜之间（图3~4）
Step 3.将样本放于载物台，软件控制采集管自动采集样本（图5）
主动黏附式采集
无需激光轰击，分离更加温和，样本所受损伤小，极大地提高了样本收集效率，样本收集全程由软件控制自动完成，对样本的干燥程度没有严格要求。收集到样本后，加入相应裂解液至管内，盖上盖子即可进行裂解。
收集样本后续处理
未染色样本切割
对组织进行连续切片，取其中一张进行染色和切割区域的选定，软件将以其为模板，自动、准确地标记出相邻非染色切片上对应的区域，此过程不受切片形状、铺片角度和位置改变的影响。
此功能既保证切割区域的特异性，同时也避免染色给样本带来不必要损伤(如RNA在染色过程中降解等)。
非染色切片切割避免染色造成的生物大分子降解
PTP技术量化样本数量
根据样本的大小及形状，智能地将黏性管盖划分为若干个区域，使用不同的区域对相应样品进行黏附，提高样品收集效率。
• 管盖精细分区进行黏附采集
• 合理有效利用黏附管盖的有限空间
• 量化具体样本数
PTP技术（Predefined Target Positioning）。被分离的细胞可以整齐地排列起来，从而可以进行严格的细胞数目控制，实现准确定量。
活细胞采集
MMI活细胞切割专用套皿，内皿用来培养细胞，其底面是膜，对目的细胞进行显微切割后，将内血取出，目的细胞即留存于外皿中，可直接刮取收集，或加入培养基继续培养。整个过程中培养皿处于密闭状态，分离的细胞可继续生长不受任何影响。
--专利的内外皿设计
--唯一保持培养皿密闭状态进行切割
--避免任何污染
德国Molecular Machine & Industries (MMI)是专门致力于将显微操作技术与高精度激光技术相结合应用于生命科学领域的一家专业公司，其标志性产品MMI CellCut激光显微切割系统和CellEctor单细胞挑选系统成为目前世界上性能优异的均质样本/单细胞获取平台。基因有限公司作为MMI在中国区合作伙伴，可为感兴趣的客户提供专业的产品咨询、技术答疑、售后安装、应用培训、联系试用等。
