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PacBio HiFi测序助力全基因组变异检测
长读长测序（Long-Read Sequencing，LRS）技术的快速发展，在过去五年内以两种方式根本性地改变了检测基因组变异的格局。首先，NGS测序通常无法发现重复序列区域的结构变异（SV），而长读长测序可以通过直接比对重复序列区域，将SV的检出率提高了3倍以上，其次，LRS使基因组组装变成常规且简单的操作，并且最新的测序技术和组装算法，可以生成完全捕获两种单倍型的分型基因组组装结果。长读长测序的进展大大的提高了我们对突变过程、复发性突变以及与疾病和适应相关的新变异的理解。
现在启动的一些大规模的测序项目，包括 All of Us 和 GREGoR 等，通过LRS揭示了大量和疾病相关的变异。对于这些大规模的测序项目来说，一个关键的问题是如何在最经济有效的LRS数据量（基因组覆盖深度）情况下得到最佳的变异检测结果，并且两个最主流的LRS测序平台，Oxford Nanopore Technologies（ONT）和PacBio HiFi sequencing，在同等的数据覆盖深度下检测变异的情况如何，也是大家都非常关心的问题，今年五月份，美国华盛顿大学的Evan E.Eichler教授团队发表了预印版文章：Whole-genome long-read sequencing downsampling and its effect on variant calling precision and recall，详细研究和评估了ONT和PacBio HiFi平台在不同覆盖度下的遗传变异的检测效果，并得出以下结论：
对于reads-based的方式，ONT和PacBio HiFi在12x覆盖度时，均可以得到良好和稳定的变异检测结果（F1 score大于0.5）； Assembly-based（基于基因组组装）可以提升HiFi数据集中SVs和indels检测的准确性和召回率，并且HiFi在基于组装的变异检测上要显著优于ONT（HiFi F1 score更高）；
1 基于Reads-based的变异检测
作者使用了DeepVariant和Clair3对单核苷酸变异（SNV）进行分析，在15倍以下的覆盖深度下，PacBio HiFi数据对SNV的召回率（Recall）始终优于ONT，平均优于ONT 0.03。在约10倍的覆盖下，HiFi数据的准确度和召回率达到一个良好的平衡点，准确度达到0.96，召回率达到0.90。在5倍覆盖下，DeepVariant和Clair3在HiFi数据中的表现也均要比ONT数据更优秀（F1值高0.05）。而对于这两个分析软件在准确度和召回率上的表现，DeepVariant在准确度方面表现更好，而Clair3则在召回率方面表现更好。ONT和PacBio HiFi在12x覆盖度时，均能得到良好和稳定的变异检测结果。 图1:不同LRS覆盖深度下SNV，InDel和SV检测的准确度和召回率情况
对于InDels（小于50bp的插入或缺失变异）的检测也呈现相同的趋势，在12x数据覆盖度可以得到一个良好的F1值，但HiFi数据和ONT数据在召回率上差异较大。在所有的测序深度下，虽然ONT数据使用DeepVariant和Clair3的准确度值都较高（平均为0.82），但和PacBio HiFi数据相比，ONT的召回率都明显偏低，在测序层数低于或等于12x时，ONT的召回率相比较HiFi平均低了0.39，而在测序层数高于12x时，ONT的召回率相比较HiFi平均低了约0.31。 而对于结构变异（SVs），两个测序平台对SVs的检测差异最小，HiFi和ONT测序平台之间的F1标准偏差为0.01，可能由于随机抽样偏差，各个软件的召回率均较低，但是PBSV和Delly检测的精度最高，并且这两个软件在低覆盖深度下始终具有高精度（平均为0.89），并随深度的增加保持一致，但在低覆盖深度（低于12x）下的召回率方面，Sniffles表现最佳，平均准确度/召回率/F1值为0.63/0.84/0.71，其次是cuteSV（0.57/0.84/0.67）。 图2:30x和12x情况下，HiFi和ONT平台使用Sniffles对SV检测韦恩图比较。 2 基于组装的变异检测
基于组装的方法可以从大的连续单倍型模块中进行变异检测，可以检测更大和更复杂的遗传变异，并为所有形式的遗传变异提供分型。作者使用了三种算法进行了组装：hifiasm、PGAS和Flye。其中hifiasm和PGAS用于组装HiFi数据，而ONT数据使用Flye进行组装，作者提到HiFi数据可以直接组装单倍型分型的基因组，而ONT数据更高的序列错误率并且缺少组装和分型结合的算法，目前基于ONT数据很难获得连续的单倍型分型的组装结果。 对于SNV的检测，基于组装的方法，ONT和ONT超长数据（ultra-long ONT，UL-ONT）均比reads-based的方法显示了较低的精度（平均降低了0.33），在数据量小于12x覆盖深度的时候尤为明显，ONT和UL-ONT的组装结果均显示了大量的假阳性变异，当覆盖深度达到12x时，基于组装的方法ONT和HiFi均显示了优秀的召回率（平均0.96），于reads-based的方法得到的结果类似。作者不推荐用低深度的覆盖率（小于12x）通过组装的方法来检测SNV，不过覆盖深度达到12x或更多时，基于组装方法的SNV检测在准确度和召回率上跟reads-based方法基本类似。 通过组装的方法检测InDels非常具有挑战，PacBio HiFi在高深度（30x）的时候显著降低了检测的假阳性结果，而ONT数据即使在高深度（30x）的时候仍然存在问题，总的来说InDels检测算法的开发和正交验证时LRS技术接下来发展的一个重要领域。 而对于SVs的检测，在高于8x的覆盖深度上，通过组装的方法检测的SVs在召回率上都优于reads-based的方法，至少提高了0.08。 图3: 不同覆盖深度下基于组装方法对变异检测的精度和召回率情况
3 不同数据集和方法比较 作者通过将GRCh38分成1Mbp窗口，与HG00733的HGSVC的SV真实数据集交叉，评估各方法和算法变异检测结果的比较。在低覆盖度（5x）下，reads-based胜过每个组装软件组装的检测。在这些低覆盖深度下，使用HiFi reads的Sniffles表现最佳，在10x及以上的深度下，这种趋势发生了转变，HiFi组装的方法优于所有基于reads-based的算法，最明显的差异发生在15x深度，此时组装后方法比reads-based多检测额外的500 Mbp和383 Mbp的基因组（分别对于插入和缺失）。 作者进一步通过HG002样本比较了这些之前已经发现的有临床相关性的SVs，这些SVs包括273个目标基因或区域，这些基因或区域映射到重复和结构复杂多态性区域。在30x覆盖度下，PBSV能够鉴定97%的这些在临床相关基因中的SVs。在所有技术类型中，在使用PacBio HiFi reads时，仅以8x测序覆盖率报告SV插入和缺失的召回率分别为0.87和0.82。
图4: 不同的覆盖深度下SV检测的方法和算法评估
另外作者还评估了一些特殊的复杂区域，如串联重复序列区域，相同多聚序列区域和大结构变异（10kb以上）等，作者发现ONT在相同多聚序列和非相同多聚序列的检测上存在明显差异，即使在高覆盖深度下，相同多聚序列中插入的召回率甚至比整个变异集合低0.10，即使在更高深度下，这些序列类型仍然存在精度较低的情况，即使是30x的reads-based的检测，这些区域的精度也显示了0.06的下降。而对于大的结构变异检测，基于HiFi数据的组装得到了最佳的检测结果。 最后，文章作者使用PacBio最新的Revio测序系统，通过一张Revio的芯片生成了HG002全基因组30x覆盖度的数据量，作者使用hifiasm对Revio产生的HiFi数据进行了组装，得到的组装结果与Sequel II HiFi数据组装的结果进行了比较。连续性（contig N50 = 44 Mbp [Revio] vs. 45 Mbp [Sequel II]）几乎一致，而准确性Revio甚至还略高（QV = 57 [Revio] vs. 55 [Sequel II]）。基于组装结果的变异检测在召回率（Pearson R = 0.984）和精度（Pearson R = 0.997）方面基本一致，并且在SNV召回率（+0.02 vs. both true stes）和插入片段检测精度（+0.06 vs. HGSVC Freeze 4）方面Revio略有改善。
参考文献 William T Harvey, et al. "Whole-genome long-read sequencing downsampling and its effect on variant calling precision and recall" BioRxiv. 2023.05.04.539448
