不同类型的泛素(Ub)链参与不同的生物过程。K48-多聚泛素链通过靶向结合蛋白介导蛋白酶体降解，因为Ub结合具有短暂性的特点，所以泛素链合成的机制难以解析。英国癌症研究所在NAT CHEM BIOL杂志上发表一篇名为Structure of UBE2K–Ub/E3/polyUb reveals mechanisms of K48-linked Ub chain extension的文章，利用近红外荧光成像技术获得大量的Western Blot、非还原性和还原性SDS–PAGE实验的定量数据解析泛素连接酶（UBE2K）介导K48-多聚泛素链形成机制和过程。

部分结果展示

作者通过E3 panel确认可激活UBE2K的E3连接酶种类，发现只有部分E3可激活UBE2K（图1），其中RNF38、BIRC2（两种E3）存在时可促进三聚泛素链（tri-Ub）合成（图2）。这说明E3与UBE2K共同作用激活Ub供体（Ub^D）向受体Ub的转移。基于LI-COR Odyssey近红外荧光成像平台分析获得高重复性（三次重复实验）和定量的数据，结果显示在高pH值条件下，UBE2K^D124A抑制di-Ub形成, UBE2K^D124N 表现出活性降低（图3）。

图1.a.E3 Panel对UBE2K催化K48-多聚Ub链合成的作用。b.UBE2K^D124变体催化多聚Ub链合成作用。

图2.时间依赖还原性SDS-PAGE结果显示E3对UBE2K^WT催化多聚Ub链的作用。

图3.a.Western blots数据显示PH值依赖UBE2K^WT, UBE2KD^124N和UBE2KD^124A 催化二聚泛素链（di-Ub）合成，重复三次。bc.不同pH值下，对（b）UBE2K^WT 、UBE2K^D124N(C)BE2KD^124A催化形成di-Ub链进行定量分析。与UBE2K^WT相比，高pH值条件下UBE2K^D124N活性降低。

作者设计了 UBE2K^F62A,A102R 和RNF38^M417A 变体验证是否会阻碍RNF38/UBE2K的结合，发现两种变体都会阻碍di-Ub合成（图4b）。使用RNF38^R454A突变体验证了RNF38关键蛋白精氨酸的重要性，该突变体降低了RNF38的活性（图4c）。设计Ub^D 变体 I36A 和Q40R，验证是否会阻碍Ub^D/RNF38表面的结合, 实验结果表明两种变体均阻碍di-Ub链合成。这可能是由于UBE2K内α2-螺旋残基与Ub^D结合,所以α2-螺旋残基115位丙氨酸（A115）突变成精氨酸阻碍了di-ub链合成。强调了UBE2K–Ub^D复合物构象的重要性。

图4均为非还原性SDS–PAGE成像结果图。b.E3分别招募野生型和突变型UBE2K时di-Ub合成结果。*为荧光标记的Ub；c.野生型和突变型RNF38存在时di-Ub合成区别。d.RNF38存在时Ub^D突变体对di-Ub合成的影响；e.RNF38分别与UBE2K ^D94A 和UBE2K ^A115R 混合时di-Ub合成结果。

图5.非还原性SDS–PAGE显示在没有E3时，UBE2K^F68A,A102R对di-Ub合成影响较小。

图6为非还原性SDS–PAGE荧光成像图。c.UBE2K^WT(左)和UBE2^KM172D,L198R（右）转移Ub^D到SMAC, SMAC-Ub_1-2, SMAC-Ub_3-5 和SMAC-Ub₅₊的结果。d.加入/不加入BIRC2^147-C条件下分析UBE2K^WT和UBE2^KM172D,L198R催化SMAC-Ub_3-5泛素化过程_。e.没有E3条件下,UBE2K变体催化SMAC-Ub_3-5泛素化过程。f.结果e中反应2min时间下合成的SMAC-Ub_n泛素化水平进行定量分析。