对人类个体基因组的变异进行全面表征对于深入了解遗传性状和疾病成因具有重要意义。在罕见病研究中，识别全局变异类型尤为重要，这些变异类型通常包括SNV、indels、短串联重复序列 (short tandem repeat, STR) 和结构变异 (structral variation, SV)。新发突变 (de novo mutation, DNM) 发生于配子形成过程中的胚系突变，可以被传递给后代，且已被证明是导致许多恶性早发型疾病的主要因素。虽然短读长测序(short-read sequencing, SRS)可以准确识别小变异 (< 20 bp)，但其检测STR、拷贝数变异 (CNV) 和SV的灵敏度有限。长读长测序PacBio HiFi技术已被用于识别患有不同遗传疾病的患者的SV，包括并多指(趾)畸形、综合征性智力障碍、无脉络膜症和畸胎瘤样横纹肌样瘤。

为了探讨HiFi 测序是否能够全面识别trio家系基因组中所有类型的DNM，近日，来自荷兰Radboud大学医学中心的研究人员与合作者在Genome Medicine杂志上发表了题为“Comprehensive de novo mutation discovery with HiFi long-read sequencing”的文章。研究者发现，高准确度的HiFi 测序可以作为单一技术 (不需要短读长测序数据作为补充) 生成最全面的变异数据集，HiFi 测序对于检测DNM尤其有利，其检测灵敏度甚至高于短读长测序。

为了证明PacBio HiFi测序在DNM检测中的实用性，研究者使用高覆盖度HiFi测序 (30x) 以及Illumina短读长测序 (50x) 对8个trio家系基因组进行了测序，并对不同变异类型的DNM进行了分析。

图1：研究概览。

结果表明，SRS和HiFi数据检测SNV的一致性为 94.0%。在HiFi数据特异检出的SNV和indel中，分别有大约50%和25%是在SRS数据没有覆盖到的基因组区域中检测到的。此外，HiFi特异性indel的MIE比例 (8.9%) 低于SRS特异性indel的MIE比例(13.0%)，表明HiFi数据更适合用来进行indel检测。

基于PacBio HiFi数据，每个患者平均检测出84个 (共672个) 小片段DNM，包括75个SNV和9个indel (2-50 bp)。基于SRS数据，每个患者平均检测出107个 (共859个) 小片段DNM，包括95个SNV和12个indel。两个平台对小片段DNM的检出一致率分别为92%和84.5%，其中对于编码区小片段DNM的检出一致率为100%。此外，利用HiFi和SRS数据，研究者还分别检出了28个和126个新发STR (检出一致率分别为3.6%和0.8%) 以及24个和1个新发SV (检出一致率为4%和100%)。

图2：两种测序平台对小片段新发突变 (DNM) 的检出统计。

对于54个HiFi特异性小片段DNM，研究者成功验证了27个，其中11个 (41%) 被确认为真正的新发事件。对于SRS特异性小片段DNM，研究者验证了133个中的42个，其中8个 (19%) 被确认为真正的新发事件。对于23个HiFi特异性SV，研究者确认其中10个 (52.6%) 是真正的新发事件。该结果表明，尽管新发SV很少见 (发生率仅为0.375)，但使用HiFi测序能够可靠的识别那些SV，而无需依靠增加假阳性候选SV的数量。

使用HiFi测序技术检测小片段DNM的一个潜在优势是可以对DNM进行phasing并根据遗传变异确定亲本来源。 研究者利用HiFi数据进行phasing，产生的单倍型块平均长度为570 kb ，能够将96%的DNM分配到不同单倍型块。而基于SRS数据产生的单倍型块的平均长度仅为1.2 kb，只能够将20%的DNM进行分配。对于成功phasing的DNM，SRS和HiFi数据之间的一致性>90%，表明phasing有助于区分真阳性和假阳性DNM。研究者认为，phasing的好处不仅能够提高对DNM特异性检出，而且还可以增加合子后DNM和体细胞DNM的特异性，为更加深入的研究DNM生物学提供见解。

图3：小片段DNM的phasing。

基于HiFi测序可以获得全面准确的全基因组数据集，研究者认为，仅依靠HiFi技术就能够获得对SNV、indel、STR和SV的准确检测。这一事实使对“所有”疑似遗传导致的罕见病患者进行一次综合检测研究病因成为可能。HiFi数据的高准确性能够对所有类型的DNM进行灵敏的检出以及phasing，而DNM是导致许多恶性早发型疾病的主要原因。

相关文献

Kucuk et al. Comprehensive de novo mutation discovery with HiFi long‑read sequencing. Genome Medicine (2023) 15:34. 

doi: https://doi.org/10.1186/s13073-023-01183-6.