蛋白组学

质谱制样的困难

    在进行蛋白质质谱分析时，需要对样品进行前处理，如裂解和消化。传统的制样方法存在一些问题，例如在细胞裂解液中加入去垢剂会给下游实验带来干扰；包含蛋白/多肽除盐和消化等在内的多个人工操作过程会引入更多的可变性；基于过滤的多肽回收，离心和重悬等步骤造成的损失；整个制备过程耗时长难以实现平行处理等。因此，开发一种高效的样品前处理方法对于蛋白质质谱分析非常重要。Covaris基于此提出了自己的解决方案。

Covaris的优势

    专利的自动声波聚焦（AFA）技术通过球面固态超声换能器将声波聚焦到样本区域，对样本进行处理，如图1所示。聚焦声波能够以极低的能量输入获得良好的处理效果，避免传统超声能量过剩可能引起的样本处理过度及热损伤，如图2所示。

图1.AFA技术示意图

图2.准确聚焦能量，维持恒定低温

     Covaris是一种非接触式方法，这意味着在碎裂过程中不会物理接触样品,降低了污染的风险并提高了结果的可重复性。

     Covaris可将样本破碎至微米级别，如图3所示。在充分裂解组织细胞的情况下，避免生物大分子损伤，进而显著提升组织样本尤其是少量及微量珍贵样本提取的得率和质量。

图3.AFA技术可将样本破碎至更小单位

    促进质谱制样过程中的酶解效率。对于氨基酸序列不同、翻译后修饰不同的蛋白，胰蛋白酶可能存在漏切的情况，进而造成肽段过大，质谱识别困难。基于AFA技术的Covaris可以提高酶解效率，将酶解时间压缩至30min，促进蛋白质片段化。如图4所示，Covaris提供的消化肽(10分钟、30分钟、60分钟)与16小时消化相比，显示出更高的BSA序列覆盖率。特别是在30分钟条件下，直方图代表最大覆盖率85.7%，远高于传统孵育的方法。

图4.30min的Covaris辅助酶解得到的结果显示覆盖率高于16h传统孵育酶解得到的

   Covaris可增强蛋白酶解后的洗涤效果，促进多肽复溶。

     修饰后蛋白富集与捕获方法 (APAC)为蛋白质组学提供了直接、可重复且无毒的FFPE组织样品制备方法：该方法完全消除了现有的依靠二甲苯脱蜡的缺点，保证了蛋白质组的分析深度、解交联效率和蛋白质丰度的动态范围，同时也提高了重复性。将FFPE样本蜡卷加入96孔板中，通过加热(95℃) 结合AFA 超声处理进行解交联同时乳化石蜡。蛋白结合在磁珠上进行纯化，后用异丙醇洗涤除去残留的石蜡。随着乳状上清液逐渐变得澄清，石蜡也被逐渐清除至完全清除。最后，在磁珠上进行胰酶消化，得到纯净的肽溶液，在 LC-MS 上机之前通过 SDB-RPS Stage Tips 对其进行脱盐如图6所示。

图6.FFPE样本蛋白质谱样品制备方案

     超低样本起始量蛋白组学研究：在实际科研过程中，研究人员经常会面临样本量非常稀少的情况，如何以损失量最少的方法将最多的样本信息传递给质谱仪，成为了制样过程中一个备受关注的问题。Covaris此时展现了自己的实力。如图所示，使用2000个细胞的初始样本量，分别通过溶液裂解、探头超声和Covaris的AFA技术进行样本破碎进而提取蛋白进行质谱分析。通过溶液裂解的样本最终仅有1286种蛋白被质谱仪鉴定到；探头超声处理的样本也仅有2582种蛋白被质谱仪鉴定到；使用Covaris AFA技术处理的样本被质谱仪鉴定到了3370种蛋白，该结果相当于通过溶液裂解的方式处理1*10⁷个细胞所得到的质谱分析结果。

图7.不同裂解方式对蛋白质谱分析的影响

划重点！