传统的SMA筛查测试使用基于例如多重连接探针扩增技术（MLPA）和qPCR，确定7号外显子的SMN1拷贝数，以及基于二代测序（NGS）的SMN1检测方法。然而这些方法：

1，不能识别除c.840C>T以外的致病变异

2，传统NGS无法准确分析序列高度相似的基因

3，无法区分等位基因单倍型

区分单倍型对于识别在两个等位基因（1+1）上携带正常SMN1基因的个体与在一条染色体上具有两个SMN1拷贝而在另一条染色体上具有0拷贝的沉默携带者（2+0）之间的差异很重要。沉默携带者约占非洲人口携带者的27%，占其他人口携带者的3%–9%。

“双拷贝SMN1等位基因”意为，具有两个拷贝SMN1的等位基因发生在同一染色体上。先前的研究已经识别到g.32134T>G作为双拷贝SMN1等位基因的标志物，但同样，基于短读长NGS的方法由于序列相似性高而难以区分SMN1和SMN2，也难于识别这些标记。

为了更好地促进SMA筛选，迫切需要一种进行全面的全基因SMN1和SMN2分析的方法。理想情况下，该方法应能够

（1）基于c.840C>T识别完整SMN1和SMN2的拷贝数

（2）识别SMN1中除c.840C>T以外的致病变异

（3）识别沉默型携带者

因而，HiFi长读长测序是解析具有高序列同源性的区域的理想选择，之前在一项针对中国人群的基于扩增子的研究中，已经证明了SMN1中长读长PacBio HiFi测序的实用性。

该研究使用最新的Paraphase软件，它基于HiFi数据进行的SMN1和SMN2基因分析。Paraphse提取SMN1或SMN2基因的HiFi 序列，并将其重新比对到SMN1区域。确定了整个44 kb长片段区域（chr5:70917100-70961220，GRCh38）的变异位置，其中包括SMN1基因主体区域及上/下游区域。然后通过连接每个变异位点的区段来组装单倍型(图1)。根据c.840位点的序列将单倍型分配给SMN1或SMN2，即C为SMN1，T为SMN2。此外，Paraphase识别了常见的截短型SMN△7-8，其外显子7-8缺失了6.3 kb。解决了完整的单倍型后，Paraphase通过比对参考基因将变异进行单倍型区分。Paraphase也将单倍型标记为单倍群，以实现进一步的基于单倍型的分析，以鉴定遗传标记。Paraphase可用于全基因组测序（WGS）和基于杂交捕获富集方法的HiFi数据。

图1.分阶段SMN1和SMN2单倍型

Paraphase产生单倍型标记节段，以便于检查单倍型，并将所有相关读数重新排列到SMN1。

在该研究中，纳入了107个Coriell样本，其中7个来自GIAB，100个来自HPRC。还包括了来自Children’s Mercy Kansas City的GA4K的9个携带者（1+0）样本。最后我们纳入了来自 100,000 Genomes Project中的一个SMA 三人家系。有119个具有SMN1 拷贝数信息的样本和116个具有SMN2 拷贝数信息的样本。

人口样本我们包括来自五个种族的341个家系（26个双人家系，308个三人家系和7个四人家系），以研究SMN1和SMN2等位基因的共分离。

将Paraphase得到的SMN1和SMN2 拷贝数结果与，包括基于NGS的WGS、MLPA和SMA Trio推导正交方法进行了比较。SMN1的拷贝数报告一致性为99.2%，SMN2为100%。并识别出了截短型SMN△7-8，其外显子7-8缺失了6.3 kb。

将Paraphase应用于我们收集的人口样本925个SMN1单倍型和645个SMN2单倍型（不包括SMN△7-8）进行了全人群单倍型分析，分别鉴定了10个和9个主要的SMN1和SMN2单倍型。

单拷贝SMN1等位基因

S1-1是所有种族中最常见的单倍型，频率从非洲人的29.9%到东亚人的83.3%不等。S1-2和S1-3在欧洲人，南亚人和混血美国人中也很常见（10%–20%），而在非洲人和东亚人中则不太常见（<3%）。值得注意的是，它不是参考基因组（GRCh38）代表的最常见的单倍型S1-1，而是S1-2。此外，我们观察到了几个非洲特有的单倍群（S1-7，S1-8，S1-9，S1-9d和S1-10)。

图2.全人群单倍型分析确定了主要的SMN1和SMN2单倍型

每个SMN1和SMN2单倍型的基因区域的代表性单倍型序列用于创建无根树。中间的红色虚线分隔SMN1（左）和SMN2（右）。

双拷贝SMN1等位基因

非洲个体约45%–50%的人群携带>2个SMN1拷贝，高于其他种群。双拷贝SMN1等位基因的频率较高，导致2+0沉默携带者的频率较高（估计约占所有携带者的27%），有个体具有两个SMN1拷贝，但都发生在同一染色体上。如果没有谱系信息，使用当前技术不可能直接检测到两个拷贝的SMN1等位基因。

g.27134T>G通常用作双拷贝SMN1等位基因的标记。在我们的数据中，该SNP仅在单倍群S1-8（21.9%），S1-9（100%），S1-9c（100%）和S1-9d（96.3%）中发现。因此它不是双拷贝SMN1等位基因的准确标记。相反，使用HiFi数据，Paraphase可以准确地区分S1-9d或S1-9c与S1-9。此外，能够识别该对的另一个单倍型S1-8，进一步提高了检测双拷贝SMN1等位基因的准确性。

这一研究对人类基因组中最困难，临床上最重要的区域之一的变异进行了最全面的分析。正如通常所做的那样，除了主要基于c.840C>T的拷贝数测试之外，Paraphase通过对长读长数据的变异位置进行单倍型分析，检测其他致病变异，并能够对沉默携带者进行基于单倍型筛查。可以在捕获或扩增完整的SMN1/SMN2区域时适应于扩增子测序数据。高度准确的HiFi数据可以通过整个基因提供单倍型信息，并且可以轻松地提取大的结构变异，例如SMN△7-8中的6.3 kb缺失和SMN1单倍型S1-9d中的3.6 kb缺失。

     在这项研究中，我们对SMN1和SMN2进行了多人群全基因单倍型分析。结合我们的基因水平单倍型和谱系信息，我们确定了形成双拷贝SMN1等位基因的单倍型。最重要的是，确定了一个常见的双拷贝SMN1等位基因，占非洲人双拷贝SMN1等位基因的67.7%。

此项研究仍受限于样本数量，未来使用Paraphse对大量人群的HiFi WGS数据或捕获方法得到的HiFi长读长数据进行分析，将可以更好地表征两个基因的变异，鉴定更多不同的单倍型，分析携带两个或更多SMN1或SMN2拷贝的所有基因，并发现更多用于沉默型携带者检测的遗传标记。

相关文献

Chen X,Harting J,Farrow E,Eberle MA et al.Comprehensive SMN1 and SMN2 profiling for spinal muscular atrophy analysis using long-read PacBio HiFi sequencing. Am J Hum Genet. 2023 Feb 2;110(2):240-250.