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Cytation在细胞凋亡中的应用— label free计数法探究细胞凋亡
Cytation Agilent 高通量 无标记 高对比 引言 表型药物筛选是基于生物体表型的药物筛选方法,传统表型药物筛选是在动物疾病模型上筛选能够改变表型的化合物,再深入探索化合物发挥药理作用的靶点及作用机制。表型微阵列是一种独特的无标记计数技术，用于靶细胞模型中细胞代谢表型筛选。 本文通过添加单一来源的营养成分作为细胞培养基，并测量不同营养底物培养下细胞的代谢活性，可以根据细胞活性验证代谢途径，以及细胞对不同营养介质的灵敏度。文中将MDA-MB-231细胞铺在3个PM-M TOX1板中，将二氧化碳浓度控制在5%的环境下孵育16h，然后加入不同浓度梯度促凋亡抗肿瘤药物Oridonin，进行长时间动力学观察。 作者使用Cytation细胞成像多功能微孔板系统，分别检测16h，40h，64h时间点下，590nm和750nm的吸光度值以及4x和20x的明场细胞成像效果，并用Gen 5软件对总细胞和凋亡细胞的数量进行分析，来筛选不同的营养通路。
结果与讨论 1 MDA-MB-231细胞代谢分析。MDA-MB-231细胞对染料还原的速率来确定对8种不同营养来源的使用情况。结果表明：在限制营养来源的培养基中孵育24和48小时后，当葡萄糖、肌苷、葡萄糖-1-磷酸和丙酮酸为培养基添加剂时，细胞似乎保持了更高的染料还原率。在每个孵育时间内恒定的染料还原速率说明这四种添加剂在 PM-M TOX1中比其它添加剂更优先的被代谢。 在含有PM-M TOX1培养皿中指定添加剂的无葡萄糖if - m1基培养基中，以10,000个细胞/孔的密度进行细胞培养，并孵育(A) 16、(B) 40和(C) 64小时。(D)所有染料还原率的总结。 2 细胞健康。通过4x，20x倍镜观察不同时间点视野内细胞的对比情况，分析细胞的健康状态。实验结果表明：从含有葡萄糖作为补充培养基的孔中观察到大量的总细胞以及完全附着的活细胞。在含有D,L-β-羟基丁酸的培养基中则相反。在铺板16小时后，观察到大量细胞表现出典型的凋亡形态，包括收缩引起的细胞变圆和细胞质凝聚。这些形态变化持续了额外的24小时，在64小时孵育后，可以看到细胞因细胞坏死而损失，并从孔底脱离。 在16小时、40小时和64小时孵育期后，使用4倍或20倍物镜拍摄的图像，以及软件对细胞分析和圈选的结果。 3 药物复合处理效果对高能底物代谢的影响。向PM-M TOX1加入不同浓度梯度的模型抑制剂Oridonin，在多个孵育期后再次评估底物代谢差异。结果表明：草甲素抑制作用的时间和剂量具有相关性。在给药后立即定量的染料还原率显示在所有测试浓度中几乎没有波动。然而，经过24小时的潜伏期后，随着药物浓度的增加，染料的还原率开始下降。除补充葡萄糖的细胞外，在含有肌苷、葡萄糖-1-磷酸和丙酮酸的培养基中孵育48小时后，鸢尾草素的效力相似。 添加Oridonin后细胞的染料减少。在Oriidonin浓度为0-100 μM的条件下，对细胞孵育(a) 0、(B) 24或(C) 48小时后计算的初始染料还原率。 所有细胞群体的统计分析。草甲素改变细胞完整性的能力可能需要某种营养成分。不同环境中加入不同浓度Oridonin之后，通过成像对细胞进行定性和定量分析，从而确定细胞凋亡的情况。同时通过亚群分析，利用该细胞类型所表现的圆形形态和相位对比信号的变化来量化凋亡细胞数量。最终证实：草甲素对MDA-MB-231细胞有毒性作用。 基于图像法，对Oridonin处理进行评估。MDA-MB-231细胞在含d -葡萄糖-1-磷酸为营养源的孔中培养，用0 μM或100 μM草甲素处理。在0、24和48小时孵育期后，使用20倍物镜捕获图像。 凋亡细胞百分比测定。每张图像进行细胞总数和凋亡细胞亚群计数。使用4倍物镜进行相差成像。细胞分析使用安捷伦BioTek Cytation细胞成像多功能微孔板系统和Gen 5成像软件。总细胞计数主要分析参数(黄色掩码):阈值:6,000 RFU;最小物体尺寸:10 μm;最大物体尺寸:70 μm。凋亡细胞亚群分析参数(红色掩膜):圆形>0.4;平均相位对比信号:< 40000。
结论 Biolog的表型微阵列，特别是PM-M TOX1微板，提供了一种易于使用，灵敏度高的方法，来验证不同能量通路的产生以及化学抑制剂量对细胞状态影响的多方式表型分析。使用Agilent BioTek Cytation 5 细胞成像多功能微孔板系统，可以执行多参数分析应用程序。Cytation 5 细胞成像多功能微孔板系统的环境控制允许在不同的营养环境中对染料还原能力进行动力学分析。结合高对比度明场成像，然后在全细胞水平上提供更多的表型分析，以评估养分使用的影响。 最后，细胞分析可以确定每张图像的总细胞数和凋亡细胞数，并提供表型的定量评估。表型微阵列技术和基于图像的分析相结合，提供了一种多重的、无标记的活细胞评估，可用于准确地表征靶细胞表型。 如果您正在做细胞凋亡应用方向的实验，又正好惆怅于没有合适的成像分析软件，那么我们今天分享的Cytation细胞成像多功能微孔板系统联合Gen5图像数据分析软件的这个解决方案就能给您带来新的思路呀，不但能够进行酶标模块与成像模块的整合分析，还能够通过阈值设置，对不同形态的细胞以及细胞亚型进行分析，还可调取内嵌程序记忆功能有助于您实现自定义分析模块，拓展更多的分析参数及评估方向。 基因有限公司作为BioTek多年的合作伙伴，为您提供更多行业资讯、前沿技术和对点销售，如需进一步资料请与身边的基因有限公司联系或微信后台留言^_^ Authors: Brad Larson and Leonie Rieger, BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT; Jeffrey Travis and Larry Wiater, Biolog, Inc., Hayward,CA 如需要原文进行阅读，请联系我们哦！
