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【文章精读】Genome Biology｜scTAM-Seq高分辨率单细胞靶向甲基化分析

2023-02-09

来自西班牙基因调控中心的Renée Beekman课题组开发了scTAM-seq（single-cell Targeted Analysis of the Methylome）高通量单细胞甲基化研究方法，其研究成果发表在《Genome Biology》上。这是一种靶向的、无亚硫酸氢盐的检测方式，每次实验可分析多达10,000个细胞中多达650个（目前可达1,000个）CpG位点，等位基因丢失率（ADO）低至7%。研究结果显示scTAM-seq可以解析血液和骨髓中B细胞分化的DNA甲基化动态变化，识别先前被掩盖的中间分化状态。且能够同时检测单细胞的表面蛋白表达，通过蛋白表达数据将甲基化和单细胞转录组数据进行合并分析。

研究背景

CpG二核苷酸DNA甲基化（DNA甲基化）是一种在健康和疾病中用于广泛调节的表观遗传标记。迄今为止，DNA甲基化主要在批量样品中进行研究，这限制了对稀有细胞类型、细胞分化过程和细胞异质性的研究。单细胞DNA甲基化（scDNA甲基化）方法可以克服这些局限性，但覆盖人类基因组中2800万个CpG的测序工作让人望而却步。对于能够获得通量超过100个单细胞的研究方法只能获得稀疏的数据集，其中只有1-7%的CpG被随机覆盖在单个细胞中。基因组中的大多数CpG在单细胞水平上评估没有提供有效信息，因为它们要么是持续性的（未）甲基化，要么在感兴趣的组织中没有显示可变的甲基化。
大多数人体组织和细胞类型已有批量DNA甲基化数据，可用于鉴定具有可变甲基化的CpG。单细胞全基因组参考DNA图谱正在出现，并作为鉴定可变甲基化CpG的丰富资源。将测序集中在可变CpG上的靶向方法可以有效地剖析组织内DNA甲基化异质性，并补充单细胞全基因组方法。目前的单细胞靶向DNA甲基化研究仅限于每个实验少于100个细胞的通量，每个细胞少于60个CpG。为填补高通量、靶向单细胞DNA甲基化方法的现有空白，研究者开发了scTAM-seq检测手段。

研究方法

检测原理：

scTAM-seq利用了Tapestri单细胞平台的两步微流控原理和单细胞DNA文库构建核心试剂，并创新性地整合进甲基化敏感的DNA内切酶。在候选的五种内切酶中，选择了在Tapestri试剂中保存有完整活性之一的HhaI，它能够识别并且剪切没有甲基化修饰的“GCGC”位点，而无法剪切甲基化修饰的该位点。通过甲基化位点两侧设计特异性引物，没有甲基化的位点由于被剪切，无法扩增出完整的序列，而对于甲基化修饰的位点则可以扩增出这段序列，从而判断出单细胞水平特定CpG的甲基化情况（图1a）。

图1a. scTAM-Seq实验流程和检测原理

实验设计：

DNA Panel设计：424个包含有CpG的扩增子，这些CpG在B细胞分化过程中，包含造血干细胞和祖细胞（HSC）、前B细胞、未成熟B细胞、幼稚B细胞和记忆B细胞阶段，存在有不同的甲基化状态。作为对照，Panel覆盖了不含HhaI识别位点的扩增子（Non-HhaI）、B细胞分化中持续甲基化或无甲基化的CpG的扩增子，以及在印迹对照区域内包含有CpG的扩增子。
Protein Panel设计：46种偶联有寡链核苷酸的抗体。
样本类型：从骨髓和外周血分离的B细胞。
实验处理：每个样本都设置HhaI消化组和未经HhaI消化组。

研究结果

scTAM-seq展现出低假阳性和假阴性率

对照实验结果显示，无HhaI识别位点的扩增子（Non-HhaI）和持续被甲基化修饰的扩增子（Constitutively methylated），即理论上为无法被剪切的片段，在消化和未经消化的样本中表现出相同的细胞检出比例；而持续无甲基化修饰的扩增子只在未经HhaI消化的样本中检测到（图1b）。这些结果显示出scTAM-seq具有很高的消化效率。本次实验设计Panel的scTAM-seq假阳性率（FPR）低至0.2%，假阴性率（FNR）为6.7%，假阴性率的主要因素是扩增子的GC含量高以及测序深度不足。

图1b,c. 消化vs未经消化的单细胞结果比较以及scTAM-seq的假阴性率和假阳性率评估

scTAM-Seq揭示DNAm在外周血单细胞中动态变化

为评估scTAM-seq解析细胞群的能力，研究者首先分析了外周血样本中的B细胞。利用高置信扩增子覆盖的CpG的，并使用无监督聚类确定了三个细胞聚类。通过使用批量DNA甲基化参考数据将这些聚类识别为幼稚、non-switch (ns-)和class-switch（cs）-记忆B细胞（图1d）。

图1d,e. scTAM-seq对B细胞分群结果

为评估scTAM-seq是否可以解析群体内的异质性，研究者进一步对4100个ns-记忆B细胞进行了集中分析。结果显示在DNA甲基化水平上发现了该群体中的大量异质性，这与CD27和CD11c细胞表面蛋白表达的差异有关（图2a-d）。此外，将ns-记忆B细胞簇内的不同DNA模式与染色质状态关联分析表明，沿分化伪时间，甲基化减少的CpG簇（CpG cluster 1）富集在异染色质上，而甲基化增加（CpG cluster 5）在Polycomb相关的启动子中更频繁地发生（图2e）。总结来说，结果显示了scTAM-seq具有将细胞类型解析为前所未有的分辨率的潜力，表征在批量DNA甲基化数据中被掩盖的细胞亚群，并将它们与其他机制（如逐渐分化和增殖历史）联系起来。

图2. scTAM-seq识别与增殖相关的细胞状态

利用表面蛋白表达数据整合scDNAm和scRNA-seq数据

研究进一步探究scTAM-seq在骨髓B细胞分化过程中分析DNA甲基化动态变化的能力。scDNA甲基化数据的降维聚类鉴定出五组细胞，并以推断的B细胞分化伪时间轨迹排列：造血干细胞和祖细胞（HSC），前B细胞（Pre-B cells），未成熟B细胞（immature B cells），幼稚B细胞（naïve B cells）和记忆B细胞（memory B cells）。值得注意的是，幼稚、cs和ns记忆B细胞在骨髓和血液样本中均有鉴定出，展现出用scTAM-seq分析在生物重复之间的高度相关性。

图3a. scTAM-seq对ns-记忆B细胞的分群

为实现在不使用bulk DNAm数据的情况下以自动方式鉴定细胞类型，研究者利用单细胞CITE-seq参考数据结果，对scTAM-seq捕获的表面蛋白表达数据进行细胞注释（图3d）。这些注释以及簇特异性细胞表面蛋白的表达通过伪时间分析证实了B细胞分化阶段的顺序（图3e）。研究者进一步证明，表面蛋白表达数据可用于将scDNAm和scRNA-seq数据整合到公共参考空间中。这使我们能够在整个分化轨迹中识别CpGs与基因表达的反相关和相关性，例如CXCR5（负相关，CpG位于基因启动子中）和SMARCA4（正相关，CpG位于内含子区域，图3f,g）。这些分析证明了scTAM-seq剖析复杂细胞群DNA甲基化异质性的能力。

图3b-g. scTAM-seq蛋白表达数据可将scDNAm和scRNA-seq数据结果整合

研究结论

scTAM-seq为研究DNA甲基化动态变化提供了单细胞和单核苷酸分辨率的检测手段。这种方法弥补了全基因组甲基化分析是位点分散的问题，能够对更加复杂的细胞群体的靶向甲基化位点进行动态分析，是现有批量甲基化分析的有效补充和深度挖掘的手段。
基于Tapestri平台的检测能力，研究者能够将DNA突变、DNA CpG甲基化修饰、表面蛋白表达三组学整合到同一个单细胞检测流程中，揭示肿瘤克隆和亚克隆的发育过程。

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