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磷酸化蛋白检测，送经验和福利啦~
接触信号通路的同学，肯定对“磷酸化“这个名词不陌生。对于大多数通路，特定蛋白的磷酸化可以指征信号支路的激活状态。但在实验进行中，很多人发现有些磷酸化指标的检测，好像不是很容易，实验中遇到的问题也很多，数次挫败之后不免有很多疑问。面对大家常遇到的问题和疑问，今天我们就将为大家总结一下磷酸化指标检测时的要点和注意事项。
1. 总蛋白的表达 要点：先有总蛋白形式，才有磷酸化形式
磷酸化是翻译后修饰的一种，即蛋白有翻译，才可能出现其他翻译后修饰。所以，在检测磷酸化蛋白前，先需要明确样本中是否有总蛋白形式的表达。举例来说，如果样本中检测不到total-EGFR，自然也谈不上去检测p-EGFR。 此外，当发现磷酸化蛋白出现信号，但分子量大小与预计有差异时，检测总蛋白形式也能帮助判断是否由于高磷酸化或者其他翻译后修饰、亦或是收样或者电泳体系、Marker，导致蛋白分子量发生“迁移”。 在文献的结果呈现中，会同时展示磷酸化和总蛋白的信号，那么磷酸化和总蛋白按什么顺序检测呢？在样本有限的情况下，可以检测磷酸化指标，洗脱（stripping）后再检测总蛋白（stripping的时候注意温度尽量控制在50℃以内）。有可能的话，建议先通过预实验确定洗脱步骤不会对膜上靶蛋白产生影响。我们更推荐通过分开跑胶的方法，用新膜进行抗体孵育和显影。 而如果使用LI-COR近红外荧光检测方法的话，就无需跑两块胶也无需strip，可以在同一张膜上孵育磷酸化和总蛋白抗体哦。
2. 诱导磷酸化指标的表达
要点：诱导条件（药物/因子、时间、浓度）；设置阳性对照
有了总蛋白表达，第二步需要考虑的是：该磷酸化位点是否需要诱导？是否有检测时间窗？ 不同细胞中，不同磷酸化蛋白的基础水平会有较大差异（图1）。有负反馈或者降解机制的磷酸化位点，检测时间窗有限，故诱导时间一般较短（以分钟计），长时间处理后，便无法检测到信号。例如，p-IRS1的诱导一般为短时间（5分钟）; 分化后的THP-1细胞经LPS处理后检测p-IKKε(Ser172)，15分钟可看到信号，但随着LPS处理时间延长，1小时信号明显下降，6小时已无法检出信号（图2）。 图1：使用Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb #4060检测不同样本中p-AKT(Ser473)的表达。 图2：THP-1细胞（TPA, 80 nM 过夜）分化并使用1 μg/ml LPS处理不同时间（15min-24h)，裂解后进行WB，使用Phospho-IKKε (Ser172) (D1B7) Rabbit mAb #8766进行检测。
由于蛋白磷酸化是条件性产生的结果（即多数需要在诱导条件下才能产生修饰），而在探索性实验中，未知问题较多。例如：我的药物能否能在该细胞系中诱导该位点磷酸化？浓度和时间梯度是否合适？在预实验中，建议设立阳性对照（不同于内参），以帮助判断待测模型中特定位点是否被磷酸化。您可以查看说明书中WB结果图、阳性对照处理表（可以参见CST官网http://www.cst-c.com.cn/tools/Controls_Table.html），或者通过广泛阅读文献，以了解处理方式，并结合预实验摸索。
3. 蛋白样本提取 关键：磷酸酶抑制剂，冰上裂解，超声
用裂解液裂解细胞时，除了蛋白酶抑制剂混合物，还需加入磷酸酶抑制剂混合物，以抑制内源性磷酸酶的活性。 裂解后，还需使用机械力（比如超声）进一步破碎细胞。超声可以剪切染色质，从而增加蛋白溶解程度，对暴露抗原表位亦有助益。超声时，可将EP管置于冰上，使用30%-40%功率超声3次，10秒一次，每次间隔10秒（不同型号超声仪需摸索功率设置）。如没有超声仪，也可以使用细注射器针头（如24G的1 mL注射器）反复抽吸蛋白大约15次，达到类似的作用。 样本收集后，分装置于-80℃，尽量使用新鲜样本进行实验，避免反复冻融，部分磷酸化蛋白可能对冻融敏感。
4. 封闭及抗体使用 要点：实验级脱脂奶粉，一二抗稀释方法
对于封闭，建议使用5%脱脂奶粉/TBST，室温摇晃封闭1小时。奶粉的成分多样，能产生更全面的封闭效果。我们的广泛抗体开发和验证实验表明，现配现用的实验级牛奶（如 Nonfat Dry Milk #9999）不会对磷酸化信号产生任何影响。但随着牛奶溶液的保存时间延长，可能使磷酸化信号降低。食品级奶粉中添加剂众多，可能对实验产生不可控的影响。 对于一抗稀释，需参考产品网页中的步骤信息（图3），使用推荐的稀释液成分稀释一抗，4℃慢摇孵育过夜。不同产品有不同优化的稀释液，采用CST推荐的一抗稀释液并按标准protocol 操作实验，是您实验成功的保证。 图3：截图来自相关产品的产品网页 → 实验步骤 → 蛋白质印迹法，高亮处为该产品推荐的抗体稀释液成分。
二抗使用5%脱脂奶粉/TBST稀释，室温缓摇孵育1小时。BSA稀释二抗可能造成高背景或多杂带（图4）。
图4: 使用Phospho-Stat3 (Tyr705) Antibody #9131对Jurkat细胞（未经或经 Human Interferon-α1处理）进行WB分析，二抗Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody #7074分别使用脱脂奶粉或5%BSA-TBST稀释。
⚠️请注意：如后续使用荧光发光，则封闭液中不可含有Tween® 20，否则可能造成非特异信号（即使用5%脱脂奶粉-TBS封闭）
5. 洗膜及缓冲液pH值 封闭、一抗和二抗这些之后的洗膜，均建议用1*TBST （相对于PBST缓冲液，最终信号会更强）在摇床上洗膜3次，每次5min。膜分开洗涤，以确保洗膜充分且均匀。多张膜重叠洗涤可能造成部分区域洗涤不完全，导致背景升高或不匀。 所用缓冲液的pH值对结果也可造成影响。虽然很多磷酸化（如丝氨酸/酪氨酸/苏氨酸磷酸化）在非生理性pH下较为稳定，但缓冲液pH值（洗膜和抗体稀释）会影响抗原-抗体的结合反应；电泳和转膜液pH值的改变，也可能对电泳分辨率和膜转移产生不良影响。
WB常用溶液pH值 溶液 pH 相关产品 10X TBS 7.6 #12498 Tris-Glycine SDS Running Buffer (10X) 8.6 #4050 Tris-Glycine Transfer Buffer (10X) 8.3 #12539
6. 抗体选择 非常关键的是，抗体质量要好！ 磷酸化抗体，当然选择CST。 抗体具体使用条件，请严格遵照抗体说明书，这都是生产和验证抗体的科学家经过很多摸索，优化出来的适合条件。
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抗体对（Antibody Duet）是什么？
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抗体对（Antibody Duet）的优势 1. 磷酸化/剪切型蛋白和总蛋白进行对照，有理有据，不怕质疑 2. 抗体对独立包装，不需要多个订单，更免除同一个靶点众多货号难选择的问题，省时省力 3. 绝大部分备有现货，到货快 4. 抗体对中的抗体精选自CST产品库中某种特殊应用表现卓越的产品，质量上乘 5. CST有涉及各个研究领域靶点的抗体对，选择多 6. 比单独购买，优惠10%以上，划算
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附 相关产品 除磷酸化、总蛋白、内参抗体和二抗外，所涉及相关产品如下： 样品准备相关试剂： PMSF#8553 ， CellLysis Buffer (10X) #9803 ChapsCell Extract Buffer (10X) #9852 RIPA Buffer (10X)#9806 Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)#5870 Protease Inhibitor Cocktail (100X)#5871 Protease/PhosphataseInhibitor Cocktail (100X) #5872 Red Loading Buffer Pack#7723 Blue Loading Buffer Pack#7722 0.5MEDTA, pH 8.0 #7011 DTT(Dithiothreitol) #7016 WB实验过程中相关试剂： Tris Buffered Saline (TBS-10X)#12498 Tris-Glycine Transfer Buffer (10X) #12539 Tris-Glycine SDS Running Buffer (10X) #4050 Tris Buffered Saline with Tween® 20 (TBST-10X)#9997 Color-coded Prestained ProteinMarker, High Range (43-315 kDa) #12949 Color-coded Prestained ProteinMarker, Low Range (1.7-42 kDa) #13070 Blue Prestained Protein Marker, Broad Range (11-250 kDa) #59329 Color-coded Prestained Protein Marker, Broad Range (10-250 kDa) #74124 Biotinylated ProteinLadder Detection Pack #7727 NonfatDry Milk #9999 PhosphateBuffered Saline (PBS-1X) pH7.2(Sterile) #9872 PhosphateBuffered Saline (PBS-20X) #9808 NitrocelluloseSandwiches #12369 检测试剂 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody #7074 Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody #7076 20XLumiGLO® Reagentand20X Peroxide #7003 SignalFire™ECL Reagent #6883 SignalFire™PlusECL Reagent #12630 SignalFire™EliteECL Reagent #12757
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