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MERFISH空间转录组技术与电镜联用---深度解析小鼠脑组织复杂结构
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目前的空间转录组学方法可保留空间信息鉴定细胞状态，但缺乏形态学信息。扫描电子显微镜可提供纳米分辨率的结构细节，但缺乏对不同细胞状态的分子解码。 Peter Androvic等研究者使用相邻的组织切片将MERFISH空间转录组学与大面积电子显微镜形态学数据相关联，以此表征小鼠脑中与损伤相关的小胶质细胞身份，首次实现了小胶质细胞的表型和干扰素应答的小胶质细胞的转录组特征的关联。
空间转录组学方法提供了空间分辨率的基因表达谱数据，据此可深度表征组织中细胞类型和状态。这些图谱可以提供细胞的空间位置和分子表型，但是无法分辨组织的超微结构。扫描电镜可以提供纳米分辨率的组织超微结构数据，但是直接分配分子特征能力有限。为了能将分子和形态学表型数据联用，作者开发了空间转录组学联用电子显微镜(STcEM) 方法，将大面积扫描电镜和多重抗错荧光原位杂交技术(MERFISH)联用，将单个细胞的转录组数据与超微结构数据联合分析。 本研究利用小鼠脑冠状面相邻组织切片为材料，通过MERFISH技术分析鉴定了所有主要的脑细胞类型，包括谷氨酸能和GABA能神经元，少突胶质细胞，免疫细胞，星形胶质细胞，少突胶质细胞前体细胞，室管膜和血管细胞，并将它们定位到其原始空间位置(如下图1B-C所示)。此外，通过子聚类分析和参考作图的组合，确定了较小的细胞亚群，如皮层中各类血管和免疫细胞或层特异性神经元，其空间组织与预期模式匹配。 接下来，作者使用STcEM来研究毒素诱导的CNS （中枢神经系统损伤）损伤模型。单次注射溶血磷脂酰胆碱(LPC)(溶血卵磷脂)诱导小鼠脑白质中的局灶性脱髓鞘损伤。脱髓鞘损伤后，小胶质细胞和巨噬细胞增殖并迁移到脱髓鞘病变灶中，在那里它们吞噬、代谢富含脂质的髓鞘，清除受损的髓鞘，启动修复机制并与适应性免疫系统的细胞交流。以前的研究揭示了不同区域和条件下小胶质细胞转录状态的异质性，包括疾病相关小胶质细胞(DAM)，激活的反应小胶质细胞(ARM)，富含脂肪滴的小胶质细胞(LDAM)，损伤反应小胶质细胞(IRM)。作者使用STcEM将髓鞘和小胶质细胞形态的超微结构变化与脱髓鞘病变的细胞转录状态结合起来，以确定小胶质细胞和T细胞对损伤反应的感兴趣区域。由于小胶质细胞的深度积累和少突胶质细胞的缺乏，在MERFISH数据中损伤部位是明显的，而对侧半球没有这些特征(图1D)。 图1 空间单细胞转录组学与细胞超微结构进行关联 MERFISH 数据的亚聚类分析揭示了四个小胶质细胞簇的存在(图2A)。一个是表达高水平的典型小胶质细胞标志物如Tmem119，Csf1r的稳态细胞簇，在未受损半球富集。其余的簇主要定位于受损区域，表明损伤相关的小胶质细胞状态(图2B)。其中一个簇通过干扰素刺激的基因(Stat1，Ifit1，Rsad2）上调来标记，与IRM非常相似。另一簇由DAM标志物如Apoe、 Itgax、 Clec7a 的上调所定义，并且在病变部位富集，因此定义为DAM。第四个细胞簇共享DAM标志物但另外显示Gpnmb，Lgals3和与脂滴形成及胆固醇代谢相关的基因如Plin2，Soat1，Abca1和Abcg1的高度特异性上调, 因此作者将这个cluster称为脂质相关的小胶质细胞。脂质相关小胶质细胞主要位于心室边缘附近，在病变核心区富集(图2D)。 图2 小胶质细胞和T细胞的STcEM分析 为了进一步表征和验证在全转录组尺度上 MERFISH鉴定的小胶质细胞群，作者在新的小鼠队列中使用SmartSeq2方案在分选的CD11b+细胞上进行单细胞RNA测序(scRNA-Seq)。在 QC和排除较小的污染细胞群之后，从3只对照和5只LPC注射的小鼠中共获得了1017个单一的小胶质细胞转录组(图3A-C)。将MERFISH数据映射到scRNA-Seq数据上,揭示了具有高度一致性转录特征的小胶质细胞群体的存在(图3B-C)。 图3 扩展的小胶质细胞分析
STcEM拓展了当前电镜方法的检测能力，不仅能给出形态学维度的组织超微结构数据，同时也能给出分子维度的转录组学数据。这种基因通量和分子分辨率的显著提升允许对微妙的细胞状态和分子途径进行无偏倚的识别，为生物学和病理学中空间转录组与超微结构的关联分析提供了新的机会。原则上STcEM可以应用于任何组织，并且以后有望研究亚细胞结构比如细胞器的转录组，为亚细胞转录组学提供强大的方法。
参考文献：Peter Androvic,et al. Spatial Transcriptomics-correlated Electron Microscopy. BIORXIV DOI:10.1101/2022.05.18.492475 点击链接 了解更过： 人为什么会发烧？看院士庄小威如何利用MERFISH回答这个问题 MERFISH在小鼠初级运动皮层细胞类型特异性Isoform检测中的应用 期待已久！MERFISH超分辨率空间转录组学技术服务终于来了！ MERFISH助力又一巨作——【Nature】新皮质锥体神经元亚型多样性控制小胶质细胞状态 速看！Vizgen发布了新的蛋白质-MERFISH同时检测试剂盒 关键技术-MERFISH
MERFISH即多重抗错荧光原位杂交技术，突破了传统的smFISH一次检测3-5种基因的局限，通过组合标记、超高分辨率顺序成像，可同时检测多至500种基因的表达和空间定位，得出组织全景图片、细胞图片、检测到的所有转录本、显示每个转录本在细胞中的空间分布并对其定量，实现真正意义上的单细胞原位空间转录组研究。是单细胞测序技术不可或缺的验证手段，同时更加擅长检测到低表达丰度的转录本、发现新的细胞亚型、揭示微环境等,是空间转录组研究领域是不可或缺的研究手段。 基因有限公司于2022年3月正式签约成为美国Vizgen公司MERSCOPE™ MERFISH超分辨荧光显微成像分析系统在中国的总代理。负责该系统的售前技术咨询、售后安装培训、应用支持等工作。戳下图获得更多一手资料吧~
