关键词：三阴性乳腺癌，肿瘤异质性，单细胞DNA测序，多患者靶向Panel（MPT Panel）

期刊：Cell Genomics
课题组：MD安德森癌症中心Nicholas E. Navin实验室

研究亮点

• 开发出多患者靶向单细胞DNA Panel方法流程，即利用WES测定多患者的突变谱针对性定制化单细胞DNA测序Panel（Multi-Patient Target Panel，MPT Panel），经济高效地完成对特定队列的单细胞DNA测序和突变谱系分析。
  
  
• 对未经富集的细胞核进行Tapestri单细胞DNA测序结果与对经过FACS富集的肿瘤细胞核的Bulk测序分析析得到的CNV和突变结果具有高度一致性。
  
  
• 由于无法准确评估共突变，通过WES的等位基因突变频率（VAF）推测克隆结构难以准确推断克隆结构。
  
  
• 揭示出三阴性乳腺癌患者的突变谱系并鉴定出早期的突变以及CNV事件。

研究背景

三阴性乳腺癌（TNBC）是侵袭性极强的乳腺癌亚型，缺少雌激素受体（ER）、雄激素受体（PR）和HER2的表达，近一半的患者会对化疗产生耐药，并发生远端转移，因此这类患者预后较差。TNBC具有的显著特征是大范围的拷贝数变异（CNV）和TP53突变。之前的研究已经揭示TNBC呈现间断拷贝数演化（PCNE），大量CNV事件在进展的最初阶段短暂发生爆发式进化。然而TNBC进展过程中基因突变的时间和动态变化尚未被充分解析。增加对肿瘤内异质性知识的积累对于TNBC患者的临床诊断和治疗非常重要，尤其是在选择靶向治疗手段的时候。

单细胞DNA测序技术已经被广泛应用于解析瘤内异质性。低通量低深度的单细胞全基因组扩增（WGA）帮助我们在全基因组范围内寻找CNV事件，然而分析突变需要更高的测序深度和对特定位点的均一覆盖，需要靶向的高通量单细胞DNA测序。由于基因组区域过大，为了能经济高效利用单细胞DNA测序数据，本研究意在通过WES的测序得到的体细胞突变构建多患者靶向单细胞DNA Panel（Multi-Patient-Targeted Panel），进而分析TNBC的克隆结构和突变谱系。

研究方案设计

• 患者选择：五位女性三阴性乳腺癌患者，患者临床信息如下

• 样本类型：快速冰冻的肿瘤组织和对应的癌旁组织
• 实验方法：

（1）低深度单细胞WGS：对经过FACS分选的肿瘤来源的非整倍体DAPI染色大于2N的单个细胞核进行低深度单细胞WGS，分析拷贝数变异（CNV）。

• 分析细胞数量：靶向单细胞DNA测序分析得到23,500个细胞，平均每个患者得到4,700个单细胞分析结果。

2.多患者靶向单细胞DNA测序分析TNBC肿瘤克隆结构

研究方法：针对WES分析得到的330个突变设计靶向单细胞DNA测序Panel，并对未经分选的肿瘤单细胞核悬液在Tapestri上完成文库构建，进行单细胞SNV、CNV分析，并根据细胞的SNV和CNV进行聚类分析，绘制UMAP结果，并使用邻接法构建进化树。

研究发现：TN4和TN2为多克隆肿瘤。TN4细胞中分析出四个克隆群，包括三个肿瘤克隆和一个正常二倍体细胞的克隆（图3A）。在三个肿瘤克隆群中均有包括TP53基因在内的15个基因的纯和突变。单细胞CNV分析发现了GRIN3A、DMKN和IGSF10的扩增，并发现NOTCH3和15个纯和突变变基因存在拷贝数缺失。为重现肿瘤进化过程中SNV和CNV的获得顺序，根据突变谱构建出邻接法进化树（NJ tree），并显示出三个主要的分支点：最近克隆祖先（MRCA）、A1和A2。c3克隆距离MRCA最近，同时含有最少突变（n=33），分枝进化得到的c2和c1克隆分别增加8个和28个突变。有趣的是在三个克隆之外没有发现处于中间的渐进演化出的克隆。TN2肿瘤中分析出19个突变和三个克隆群。与TN4相似，TN2也没有检测到处于两个肿瘤克隆之间的克隆。

图3: 两个多克隆肿瘤克隆结果和进化树分析（左右滑动查看完整结果）

TN1、TN3和TN5三个肿瘤均为单个肿瘤克隆，大部分的突变存在在所有的肿瘤克隆中（突变数目：11～47）。此外，在TN5中检测到少量低频突变，可能是在肿瘤进展中后期谱系事件。

图4: 三个单克隆肿瘤的克隆异质性和突变谱系分析

研究方法：针对单细胞WGS的数据和单细胞MPT的数据分别整合为“pseudo-bulk”数据，进行CNV分析比较。相似的，将WES检测结果与单细胞MPT的“pseudo-bulk”分析出的突变VAF进行对比分析。对于克隆结构的分析比较中，WES的VAF结果使用PyClone2进行克隆结构推测，与单细胞DNA测序得到的克隆结构进行比较。

研究发现：CNV的比较显示Pearson相关系数显示高相关值（平均值=0.871），表明跨细胞合并单细胞reads数据，准确反映了pseudo-WGS的CNV结果。值得注意的是，所有高水平的基因扩增均被单细胞MPT测序检出（图5A）。

图5A：WGS与单细胞DNA测序检测CNV结果比较

对于等位基因突变频率（VAF）的分析结果显示，WES和单细胞测序两个数据集之间VAF的Pearson相关系数在5名患者中显示出高度相关性（平均值=0.876），表明两者结果高度一致。

图5B：WES与单细胞DNA测序检测突变结果比较

利用PyClone2对WES分析的突变VAF进行克隆结构的分析，结果显示PyClone2经常高估每个肿瘤中存在的亚克隆数量：其中两个单克隆TNBC肿瘤（TN1、TN5）被估计有 3 个亚克隆。对于这两种多克隆肿瘤，Pyclone2在TN4的外显子组数据中估计了更多的亚克隆（单细胞3个，WES为5个）和TN2（单细胞2个，WES为3个）。这些数据突出了基于Bulk测序得到的VAF推断克隆结构的挑战和不准确性，而单细胞突变数据可以准确解析克隆结构。

图5C：WES推断出与单细胞DNA测序测得的肿瘤克隆结构比较

该研究报道了通过WES结果进行患者队列进行靶向单细胞DNA测序分析的方法，并成功完成5例三阴性乳腺癌患者的克隆结构和突变谱系分析。单细胞DNA测序结果与bulk WGS和WES的分析结果不仅仅具有高度一致性，多患者靶向单细胞DNA测序（MPT scDNA-seq）能够在不经过分选的肿瘤细胞中高灵敏度地同时检测SNV和CNV。相比于WES推测克隆结构的不准确性，scDNA-seq能够直接、准确测定肿瘤克隆组成，强调了scDNA-seq在分析实体瘤克隆演化和结构的重要价值。

结果显示出，三阴性乳腺癌患者之前巨大的异质性，对于单个患者，存在单克隆和多克隆的不同结构。通过单细胞DNA测序分析出早期发生的主干变异，数据进一步表明，突变也可能在短时间内同时发生，随后是稳定的克隆扩增，形成患者的肿瘤肿块。研究意外发现，在克隆之间存在非常有限的渐进进化中间体的突变。这些数据意味着两种可能性：（1）突变是在短时间的进化中同时获得的，并且在这些事件之外的突变率非常低；（2）存在大的选择性扫描，导致优势克隆胜过其他克隆。根据本次单个时间点的研究结果，研究者无法准确区分这两种情况。

未来的重要方向将包括应用MPT单细胞测序研究早期乳腺癌，如非典型导管增生（ADH）或导管原位癌（DCIS），以更好地了解突变爆发和在更大患者队列中引发乳腺癌的早期事件。此外，将药物反应、生存和进展的临床数据与肿瘤内的数量联系起来也很重要。

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