基因融合在各种癌症类型中普遍存在，通常在肿瘤的发生和进展中发挥关键作用，也可作为治疗靶点。但是从短读长数据中分辨可变剪接、识别融合基因很具挑战性。所以研究人员就把目光投向长读长测序技术——PacBio Iso-Seq长读长转录组测序技术。Iso-Seq不仅提供了全长转录本的测序方法，还可以促进基因融合的检测，在基因融合检测中显示出巨大的潜力。

然而，目前用于长读长基因融合检测的工具只有JAFFAL和LongGF两种，在检测内含子区发生的基因融合时，它们的性能受到限制。重建未知基因融合事件的精确序列也是一个难点，这限制了对已识别的基因融合的进一步功能分析。

因此在Cancer Research发表的题为“Gene fusion detection and characterization in long-read cancer transcriptome sequencing data with FusionSeeker”的研究中， Zechen Chong研究团队开发了一种方法——FusionSeeker，来全面表征癌症转录组中的基因融合，并基于偏序对齐法准确重建融合转录本。另外，基于单碱基分辨率的HiFi测序还可以准确描述基因融合断点位置。总体而言，FusionSeeker使用HiFi reads数据能够准确地发现基因融合，重建融合转录本序列，促进下游功能分析，改善癌症的诊断和治疗。

研究人员首先在模拟数据上对FusionSeeker基因融合检测的准确性进行了基准测试。随机生成150个具有不同的表达水平(10x、50x和100x)的基因融合转录本(100个在外显子中有断点，50个在内含子中有断点)，分别用PacBio Iso-Seq和Nanopore测序技术进行测序，得到的reads均用3款长读长基因融合caller——FusionSeeker、JAFFAL和LongGF进行基因融合检测分析。

在三个基因融合caller中，FusionSeeker识别出的基因融合事件比其他两个caller更多，始终具有最高的F1分数(表1)。基于Iso-Seq数据进行FusionSeeker分析的F1分数更高，主要得益于其检测内含子区域基因融合的能力。其中FusionSeeker识别了94.67%的内含子事件，而JAFFAL和LongGF分别只识别了14.67%和54.67%(表1-1和表1-2)。

为了生成高精度的转录本序列，FusionSeeker使用包含融合基因的reads进行偏序对齐，生成每个基因融合事件的一致性序列，并评估基因融合序列重建的准确性。

在模拟数据中，FusionSeeker重构了超过99.5%融合事件的全长转录本，使用Iso-Seq和Nanopore reads的平均序列识别率分别为99.87%和99.14%(表2)。当与参考基因组对齐时，FusionSeeker转录本序列显示出比原始reads更好的一致性(图1)。相比与原始序列，PacBio Iso-Seq数据（左）通过偏序比对生成的融合基因的序列比Nanopore数据（右）显示了更高的一致性(图1)。综上所述，FusionSeeker可以准确地识别基因融合并重建全长融合转录本序列。

然后，研究人员将这三种基因融合caller应用于MCF7癌细胞系。将MCF7癌细胞系的PacBio Iso-Seq和Nanopore reads都与人类参考基因组进行比对。

在MCF-7细胞系中，FusionSeeker在Iso-Seq数据集中识别出172个基因融合，在Nanopore数据集中识别出61个基因融合，其中分别有21个和20个基因融合事件已被验证(表3)。当比较三个caller的基因融合检测能力时，在Iso-Seq和Nanopore数据中，三个caller分别报告了47和19个基因融合(图2B)。

综上，相比于Nanopore测序技术，基于Iso-Seq测序能够更加均匀地覆盖转录本全长，允许检出更多的基因融合事件。

为了证明其临床实用性，研究人员还在一个急性髓系白血病(AML)患者样本上应用了FusionSeeker。FusionSeeker识别出RUNX1和RUNX1T1之间的一个预验证的基因融合，并报告了该患者样本中另外7个可信的基因融合事件(表4)。

最后研究人员评估了由FusionSeeker生成的转录本序列。在MCF-7细胞系的Iso-Seq和Nanopore数据中，FusionSeeker转录本序列与参考基因序列的一致性显著提高，其中基于Iso-Seq生成的转录本序列更接近原始序列(图3)。

值得注意的是，通过与参考序列比较得出的一致性是对转录本序列准确性的低估，这是由于这些细胞系中存在遗传变异。这些遗传变异通常会在转录本序列中保留(图3)。在Iso-Seq和Nanopore数据集中，C/T的SNP信息均保留在chr14:37592537区域的基因融合重建转录序列中。但是在这两个测序数据中，与Nanopore数据（图4B）相比，Iso-seq数据（图4A）的测序错误和gap更少（图4）。

因此，FusionSeeker是用于长读长癌症转录组测序数据中外显子和内含子区域基因融合全面检测的更优方法，PacBio Iso-seq长读长测序则是用于转录本准确测序的更优技术。结合FusionSeeker和PacBio Iso-seq有助于发现更多新的基因融合事件，这些新的基因融合可能会对肿瘤的发生和进展有重要意义，促进下游功能和临床研究。

 喜    报 

HiFi测序新款机型——Revio于10月25日正式上市，保持HiFi测序的高准确度和长读长的基础上：测序通量在sequel IIe的基础上提升15倍；一次运行可即可获得360 Gb HiFi数据；搭载NVIDIA GPUs和Google DeepConsensus，计算能力与Sequel IIe相比提升20×；测序时间由原来的30小时降低到24小时。更好助力您的研究！！！

通量更高成本更低的Revio您不来了解一下吗？

基因有限公司作为PacBio公司在中国区的独家代理商，自2011年以来将PacBio第三代单分子实时测序技术引入国内，一直为国内用户提供专业的三代测序系统的安装培训，技术支持，应用培训与售后维护工作，赢得客户的一致好评与信任。基因有限公司将一如既往的支持越来越多的PacBio用户。