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【文章精读】Nature|单细胞DNA&Protein测序解析髓系血液肿瘤克隆演化

2022-11-09

转自 Mission Bio 基因快讯 2022-11-08 17:47 发表于重庆

收录于合集

关键词：急性髓系白血病（AML），肿瘤异质性，单细胞多组学，克隆进化

题目：Single-cell mutation analysis of clonal evolution in myeloid malignancies
期刊：Nature ( IF = 69.504)
课题组：纪念斯隆凯特琳癌症研究中心（MSKCC）Ross L. Levine课题组

研究背景

髓系血液肿瘤，包括急性髓系白血病（AML），由获得体细胞突变的造血干细胞和祖细胞的扩增引起。Bulk NGS分析表明，突变为逐步获得：具有高变异等位基因频率的突变基因出现在白血病发生的早期，而具有较低变异等位基因频率的突变在后期获得。Bulk NGS虽可以提供关于白血病生物学和预后的信息，但它无法区分哪些突变发生在相同的克隆，难以准确测量克隆的复杂性或明确阐明突变的顺序，且无法将细胞的基因变异和其免疫表型进行直接关联。

图片来源：Steensma DP. Mayo Clin Proc. 2018

研究亮点

研究发现克隆性造血（CH）和AML的不同进化模式，展示出髓系恶性肿瘤的克隆结构以及主克隆和亚克隆中不同的共突变特征。

通过单细胞多组学实现同一细胞的基因型和表型关联分析。

高通量单细胞DNA测序发现被Bulk NGS方法遗漏的克隆结构信息，展现出单细胞技术在该领域的巨大应用潜力。

研究方案设计

患者队列：123患者的146份样本，包括克隆性造血（CH，14个）、骨髓增殖性肿瘤（MPN，14个）和急性髓系白血病（AML，91份）和其他。其中AML样本中包含初诊、刚发生AML转化和大部分的复发或者难治性AML患者。
样本其他筛选条件：根据诊断时Bulk NGS结果，含有scDNA Panel覆盖的突变，且有足量细胞。
实验方法：高通量单细胞DNA&Protein测序
（1）DNA Panel：109个扩增子，31基因，覆盖在MPN/MDS/AML患者中常见突变。（2）Protein Panel：7个表面蛋白。
（3）样本类型：2014～2019年的冻存骨髓单个核细胞（BMMC）或者外周血单个核细胞（PBMC）。
分析细胞数量：分析得到146份样本中740,528个单细胞结果（平均5,072细胞/样本）

研究结果

1. 单细胞DNA测序揭示髓系血液肿瘤克隆结构

研究方法：单细胞DNA测序直接测定患者样本的克隆结构，包括克隆数目、每个克隆中的共突变模式以及突变的合子性（Fig1.b）。将146份样本按照疾病进展程度分为CH、MPN和AML，其中AML按照突变的基因（信号通路基因、FLT3或者CH中常见的DTAI基因）分为Fig1中所示的四个亚组，并比较不同亚组中的突变数量、克隆数量和多样性、以及主克隆的占比。

研究发现：从CH或者MPN到AML伴随着克隆数量和复杂性的增加，并随着AML患者获得信号通路基因突变而继续进化，克隆内突变数量与其该克隆的占比无直接相关性。

Fig.1 | Single-Cell DNA sequencing of patients with myeloid malignancies

2.主克隆特征和共突变模式分析

研究方法：为了进一步研究是否某些基因的突变会更容易出现在主克隆或者能够促进克隆的扩增，研究者比较单个突变基因所在克隆的占比（Fig2.a），并分析了主克隆和亚克隆中的共突变模式。

研究发现：IDH2、NPM1、JAK2等基因突变常发生在主克隆中，而FLT3和RAS突变只出现在低频亚克隆中。在80个AML样本中均发现DTAI突变（DTAI表示CH中常发生突变的基因DNMT3A、TET2、ASXL1和IDH1/IDH2），且这些表观遗传调控基因经常在主克隆中表现为共突变，提示其协同作用 (Fig2.b&c)，而信号通路基因的突变只发生在亚克隆中（Fig 2.d）。

Fig.2 | Elucidation of clonal dominance and co-mutation by single-cell DNA sequencing

3. 鉴定初始突变并分析克隆演化过程

研究方法：通过克隆结构的解析可以分析髓系恶性肿瘤转化过程中突变获得的顺序，并追踪克隆扩增的过程。图Fig3a,b展示出克隆性造血和AML不同的进化方式，而样本中不同克隆的初始突变集中在部分基因上。研究者进一步分析了突变获得的顺序对于克隆扩增的贡献，并着重分析了MPN转化为AML过程中克隆结构的变化。

研究发现：CH表现出单克隆结构，且每个克隆中只有一个到两个突变；而AML患者表现出复杂的线性进化和分支进化模式，造成存在主克隆和多个亚克隆的多克隆形式（Fig.3a,b）。突变获得顺序的分析显示DTAI是最常见的初始突变（Fig.3c）。共突变分析中发现，DNMT3A-IDH1/IDH2，FLT3-NPM和RAS-NPM1共突变的克隆相比单基因突变的克隆比例明显增高（Fig.3d），这说明共存基因突变的不同组合在促进AML克隆优势的能力方面各不相同。在MPN（Fig.3e, Sample A) 转化为AML（Fig.3e, Sample B)过程中伴随着克隆结构的演化，包括主克隆的变化和新克隆的出现。

Fig.3 | Identification of initiating mutations and clonal expansion through assessing optimal genetic trajectories

4. 单细胞多组学揭示基因型和免疫表型关联性

研究方法：为研究是否特定基因突变或者突变组合会影响免疫表型，研究者进行了单细胞DNA&Protein多组学分析。首先研究的是克隆性造血突变对于成熟造血谱系细胞的影响，以及在AML患者中特定突变对于表面蛋白表达的影响。接着，研究者描绘了不同克隆中（通过基因型区分）的免疫表型的组成（community为通过免疫表型的分群）。从而建立起CH和AML中的基因型和免疫表型的关联性。

研究发现：部分基因突变展示出表型差异，如克隆性造血DNMT3A的两种不同的突变分别在髓系细胞和T细胞中富集（Fig.4a），AML患者的RAS基因突变与CD11b表达升高相关，而JAK2、IDH1、TET2、RUNX1的突变则与更高的CD34表达相关。研究发现多个重叠的免疫表型状态发生在具有不同基因型的样本中，且没有一个细胞群（community）是单个样本独有的，信号通路的突变诱导出现不同的免疫表型变化。

Fig.4 | Simultaneous single-cell DNA and cell-surface protein expression sequencing

结论与讨论：

对克隆性造血、AML患者的克隆结构和演化分析显示髓系恶性转化的限速步骤是从疾病初始克隆到白血病克隆的进化。以前的研究已经使用Bulk NGS分析来预测克隆进化的重要特征，然而驱动髓系细胞恶性转化事件的分子序列尚未在单细胞克隆水平上解析。在这项研究中，研究者使用单细胞DNA测序来绘制髓系恶性肿瘤中的克隆进化过程，并深入了解髓系恶性转化的发病机制。

这些研究数据表明，髓系血液肿瘤表现为一个复杂的克隆生态系统，随着时间的推移而进化，单细胞DNA测序让我们得以一瞥Bulk NGS所看不到的现象。更多针对不同癌前病变和恶性肿瘤的研究将提供有关恶性肿瘤如何发生和进展的更多重要信息，并将促进新的治疗策略的制定：阻断癌前病变克隆的进化，并制定针对多克隆疾病的治疗方案。

该研究使用的Panel基因列表如下，详细信息可在https://designer.missionbio.com/ 查询。

参考文献：

Miles, L.A., Bowman, R.L., Merlinsky, T.R.et al. Single-cell mutation analysis of clonal evolution in myeloid malignancies. Nature 587, 477–482 (2020). https://doi.org/10.1038/s41586-020-2864-x

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