文献解读 | 《宿主细胞残留 DNA 片段大小分布检测方法的建立及验证》

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文献解读 | 《宿主细胞残留 DNA 片段大小分布检测方法的建立及验证》

2022-11-03

安捷伦诊断与基因组学.

安捷伦诊断与基因组学事业部积极拓展在肿瘤、生殖健康与遗传、血液学疾病、传染性疾病等的临床诊断应用，并为转化医学研究、体外诊断企业、抗体和核酸类药物企业的研发与生产，提供最新的技术与综合解决方案。

在全球生物医药产业发展快速上升的时期，疫情时代的医药产业迎来了新一轮的变革，细胞与基因治疗的药物被认为是未来医药领域发展的潜力，成为当今增速最快的创新药物领域之一。国家药监局对这一领域的发展高度重视，为规范和指导体内基因治疗产品的药学研发、生产和注册，于今年 5 月 31 日，在国家药品监督管理局的部署下，药审中心发布了《体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》。

该《指导原则》明确规定，“生产若使用了肿瘤细胞系（如 Hela 细胞）、致瘤细胞系，或携带有致瘤基因、病毒来源序列的细胞（如 HEK 293T 细胞），在确保无完整活细胞残留的同时，需对 DNA 的残留量和残留片段大小进行控制，合理拟定标准限度。如有可能，建议尽量将残留 DNA 控制在 10ng/剂以内，DNA 残留片段的大小控制在 200bp 以下”。

这是国内的指导原则首次将风险性 DNA 残留片段的大小控制在 200bp 以下进行明文规定，其实早在 2010 年 FDA 发布的生物制品相关指导中，就有强调根据不同细胞系来源和遗传背景需要，可通过降低残留 DNA 的含量、减小残留 DNA 片段的大小（如 DNase 或其他办法处理）至功能基因大小以下，在终产品中需要检测残留 DNA 的含量和片段大小分布情况。现有研究表明，一个功能基因至少在 200bp 以上，因此，为减少残留 DNA 风险，FDA 建议残留 DNA 片段不大于 200bp。DNA 片段大小风险等级如下表：

DNA 片段大小风险等级划分

宿主细胞残留 DNA 片段 bp	风险因子
＜200	1
200-1000	2
＞1000	3
＞2000	4

注：风险依风险因子数值递增

那么，宿主细胞残留 DNA 片段大小应该用什么技术平台进行检测呢？

我们分享一篇武汉生物制品研究所发表的使用毛细管电泳平台分析宿主细胞残留 DNA 片段大小的方法验证文章。

目的：

建立宿主细胞残留 DNA 片段大小分布的检测方法，并进行验证，为监控疫苗生产过程提供依据。

方法：

基于安捷伦公司生产的高灵敏的芯片式毛细管电泳法，用 MDCK 细胞基因组 DNA 作为阳性对照品，建立检测方法，并验证方法的检测范围、准确性及精密度。利用建立的方法分析 MDCK 细胞基质流感疫苗生产过程中间品（H1N1 型流感病毒收获液、病毒微滤液、核酸酶处理收获液、浓缩病毒液、层析病毒液）残留 DNA 片段大小分布。

结果：

该方法检测范围为 35 ~ 10380 bp，精密度检测 CV 均小于 10% 。用该方法检测 H1N1 型流感病毒疫苗中间品，结果显示收获液及病毒微滤液外源 DNA 片段较大，经核酸酶处理后，大部分残留 DNA 小于 300 bp，所有残留 DNA 平均大小约 100 bp，且层析病毒液 300 bp 以下片段占总外源 DNA 的 84%。

注：最小 DNA marker 35 bp，最大 DNA marker 10 380 bp，其余为不同大小的 DNA 片段

图 4 H1N1 病毒收获液（A）、病毒微滤液（B）、核酸酶处理收获液（C）、浓缩病毒液（D）、层析病毒液（E）样品芯片电泳图及模拟琼脂糖凝胶电泳图