在上一节，我们了解到细胞死亡的分类、以及细胞程序性死亡经典的形式—经典的凋亡（点击回顾）。本节，我们接着说细胞程序性死亡新形式—程序性坏死（包括坏死性凋亡、焦亡、铁死亡和 NETosis）

扫码查看：坏死性细胞死亡信号通路图

坏死曾被经典地定义为非程序性的细胞死亡，该死亡由剧烈的化学或物理损伤所引起。可能导致此细胞意外死亡的外力包括极端的物理温度、压力、化学应力或渗透压。细胞破裂是坏死的特征，可导致细胞内含物泄漏到细胞外空间。

这会导致称为损伤相关分子模式（DAMP）的生物分子的释放，这些分子可以被免疫细胞识别并触发炎症反应。但是，最近的研究发现了几种可能触发坏死细胞死亡的调控通路。这些程序性坏死通路包括坏死性凋亡、焦亡和铁死亡。

坏死性凋亡是一种细胞自我毁灭的过程，当凋亡被另行阻止时，通过细胞外信号（死亡受体-配体结合）或细胞内信号（微生物核酸）被激活。坏死性凋亡本质上是高度免疫原性的，并且可用作抵御病原体的宿主防御机制。它还可在炎性疾病、神经退行性和癌症中被激活。

坏死性凋亡是程序性坏死细胞死亡的一种独特形式，其独立于 caspase 活性而进展。相反，它需要 MLKL 的 RIPK3 依赖性磷酸化（人类中为 Ser358，小鼠中为 Ser345）。这种磷酸化事件使 MLKL 在质膜上产生孔复合体，从而导致 DAMP 的分泌、细胞肿胀和膜破裂。

在经典通路中，在与 RIPK1 形成复合体后，RIPK3 通过在Ser227（小鼠中为 Thr231/Ser232）位点的磷酸化而被激活。可以使用磷酸化特异性抗体通过检测自身磷酸化位点（例如Ser166 和 Ser14）来监控 RIPK1 的活性。值得注意的是，RIPK1是高度调节的，并在启动 NF- κB 信号转导和存活、凋亡或坏死性凋亡的复合体中发挥作用。因此，分析关键蛋白 RIPK1、RIPK3 和 MLKL 的磷酸化状态是识别坏死性凋亡的重要步骤。此通路的其他触发因素包括 TRIF 和 ZBP-1 的病原体激活，随后与 RIPK3 相互作用并激活 RIPK3。

• RIP (E8S7U) XP® Rabbit mAb #73271

坏死性凋亡是通过形成一种称为坏死小体的复合体而引发的，该复合体包括 RIP 激酶（RIPK1）和 RIPK3。

• Phospho-RIP (Ser166) (D1L3S) Rabbit mAb #65746

坏死信号 Z-VAD、SM164 和 TNF 诱导 RIPK1 在 Ser166 位点的自磷酸化；该磷酸化被坏死抑制素抑制。

•Phospho-RIP3 (Ser227) (D6W2T) Rabbit mAb #93654

在 Ser227 位点的 RIPK3 磷酸化是通过与 RHIM 域蛋白（如 RIPK1）的相互作用来诱导的，是坏死性凋亡所必需的。

•Phospho-MLKL (Ser345) (D6E3G) Rabbit mAb #37333

RIPK3 诱导的 MLKL 磷酸化触发孔形成，是坏死性凋亡所必需的。

• Necroptosis Antibody Sampler Kit #98110

包含：RIP (D94C12) XP® Rabbit mAb #3493，Phospho-RIP (Ser166) (D1L3S) Rabbit mAb #65746，MLKL(D2I6N) Rabbit mAb #14993，Phospho-MLKL (Ser358) (D6H3V) Rabbit mAb #91689，RIP3 (E1Z1D)

Rabbit mAb #13526，Phospho-RIP3 (Ser227) (D6W2T) Rabbit mAb #93654，Anti-rabbit IgG, HRP linked Antibody #7074

• Mouse Reactive Necroptosis Antibody Sampler Kit #47928

包含Phospho-RIP (Ser166) (E7G6O) Rabbit mAb #53286，RIP (D94C12) XP® Rabbit mAb #3493，Phospho-RIP3 (Thr231/Ser232) (E7S1R) Rabbit mAb #91702，RIP3 (D8J3L) Rabbit mAb #15828，

Phospho-MLKL (Ser345) (D6E3G) Rabbit mAb #37333，MLKL (D6W1K) Rabbit mAb (Mouse Specific) #37705，Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody #7074

经典通路通常被描述为通过两步过程发生。在第一个“启动信号”步骤中，激活 NF-κB 以诱导多种蛋白质的表达，这些蛋白质将成为炎性小体复合体的组分。炎性小体通常包含一个胞质模式识别受体 (PRR；例如 NLRP3 或 AIM2 样家族成员）、一个接头蛋白（例如 ASC/TMS1）和 pro-caspase-1。通过检测NLRP3 和可视化 ASC 斑点来分析炎性小体的激活是监测焦亡的另一种有用技术。

在第二个激活步骤中，caspase-1 被蛋白水解激活，而后剪切gasdermin D 和细胞因子 pro-IL-1β 和 pro-IL-18 ，产生其促炎症形式 IL-1β 和 IL-18，它们是由死亡细胞分泌的。可以通过使用特异性抗体来监测这些重要细胞因子的变化。一旦 GSDMD 被caspase-1 剪切形成膜孔，就会分泌细胞因子，水的流入最终会导致细胞破裂。

• Cleaved Caspase-1 (Asp296) (E2G2I) Rabbit mAb #89332 

Caspase-1 在典型的焦亡过程中被蛋白水解激活并被分泌到细胞外。对剪切的caspase-1 具有特异性的抗体可以用于监测焦亡。

• Cleaved Gasdermin D (Asp275) (E7H9G) Rabbit mAb #36425 

Gasdermin D 的 N 端片段是由炎症性 caspase 剪切产生的，可用于监测焦亡。

• Cleaved Gasdermin D (Asp276) (E3E3P) Rabbit mAb #10137

Gasdermin D 通过寡聚作用在质膜上形成溶孔，作为焦亡的下游效应器起关键作用。

• Cleaved-IL-1β (Asp116) (D3A3Z) Rabbit mAb #83186

IL-1β 通过 caspase-1 的剪切而被激活，并被经历焦亡的细胞分泌。

• Pyroptosis Antibody Sampler Kit #43811

包含：Gasdermin D (E8G3F) Rabbit mAb #97558，Cleaved Gasdermin D (Asp275) (E7H9G) Rabbit mAb#36425，Caspase-1 (D7F10) Rabbit mAb #3866，Cleaved Caspase-1 (Asp297) (D57A2) Rabbit mAb #4199，IL-1β (D3U3E) Rabbit mAb #12703，Cleaved-IL-1β (Asp116) (D3A3Z) Rabbit mAb #83186，Caspase-4 Antibody #4450，Caspase-5 (D3G4W) Rabbit mAb #46680，HMGB1 (D3E5)Rabbit mAb #6893，Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody #7074

• Mouse Reactive Pyroptosis Antibody Sampler Kit #98303

铁死亡是最新描述的程序性细胞死亡形式，具有独特的形态和生化特征。这是铁依赖性细胞死亡，可导致脂质过氧化物增加。因此，它主要受促进铁稳态和氧化应激的通路调节。铁稳态部分受铁蛋白（FTH）的调控，铁蛋白是一种大型蛋白质复合体，负责以无毒形式运输铁。铁蛋白的水平可以通过针对铁蛋白的选择性自噬过程（称为铁蛋白吞噬）来调节。该通路是由核受体共激活因子 4（NCOA4）介导的，后者是铁蛋白的选择性运输受体。已证明使用某些常见的铁螯合剂（如去铁胺）可抑制铁死亡。

调节细胞防御氧化应激的通路对于缓解铁死亡至关重要。小分子亲脂性自由基清除剂（如 ferrostatin-1 和 liproxstatin-1）可以抑制铁死亡。尤其是，谷胱甘肽通路已被确定为关键的抗氧化剂防御通路。代谢蛋白谷胱甘肽过氧化物酶 4（GPX4）是这一过程的核心参与者，它可以将谷胱甘肽（GSH）转化为氧化型谷胱甘肽（GSSH），从而通过限制细胞毒性脂质过氧化作用来保护细胞抵抗铁死亡。谷胱甘肽过氧化物酶通路进一步受到 System Xc- 的调控，它是由 SLC7A11 和 SLC3A2 的异二聚体组成的氨基酸反转运蛋白，对 GSH 合成至关重要。重要的是，一种诱导铁死亡的方法是使用直接抑制 System Xc- 功能的化合物伊拉斯汀（erastin）。

涉及氧化应激的基因（包括 GPX4）的调节在很大程度上受转录因子 NRF2 的调控。这是对抗铁死亡的关键防御措施。在正常情况下，NRF2 的表达通过与 KEAP1 相互作用而受到抑制，KEAP1 是泛素 E3 连接酶复合物的一部分，可导致 NRF2 蛋白酶体降解。氧化应激会导致 KEAP1 的构象变化，从而破坏这种相互作用，因此使得 NRF2 稳定。该过程可被自噬通路进一步调节，其中自噬运输受体 p62/SQSTM1 可以竞争性地抑制KEAP1-NRF2 复合体，从而导致 NRF2 上调。

• Cellular Glutathione Detection Assay Kit #13859

还原型谷胱甘肽的存在对于防止由活性氧引起的细胞损伤很重要。谷胱甘肽的消耗是细胞死亡进展的指标。

• FTH1 (D1D4) Rabbit mAb #4393

铁蛋白 (FTH) 是一种普遍表达和高度保守的蛋白，通过隔离和储存离子在铁平衡中发挥主要作用。

• GPX4 Antibody #52455

谷胱甘肽过氧化物酶 4（GPX4）通过限制细胞毒性脂质过氧化作用来保护细胞免于铁死亡。

• KEAP1 (D6B12) Rabbit mAb #8047

控制氧化应激的基因调节是对抗铁死亡的关键防御蛋白。在正常情况下，NRF2 的表达通过与 KEAP1 的相互作用而受到抑制。

• NCOA4 (E8H8Z) Rabbit mAb #66849

核受体共激活因子 4（NCOA4）是一种选择性运输受体，其介导铁蛋白的水平并参与铁蛋白吞噬过程。

• NRF2 (D1Z9C) XP® Rabbit mAb #12721

在氧化或亲电应激后，NRF2 从 KEAP1 中释放，从而允许这种转录激活剂转移到细胞核并调节氧化应激反应基因。

• NRF2 (D9J1B) Rat mAb (IF Specific) #14596

该 NRF2 抗体是专门设计用于免疫荧光实验，以可视化 NRF2 在细胞内的定位。

• xCT/SLC7A11 (D2M7A) Rabbit mAb #12691

xCT/SLC7A11 是异二聚体氨基酸转运系统 x(c)(-) 的一部分，该系统调节细胞内谷胱甘肽（GSH）的水平，这对于保护细胞免受氧化应激至关重要。

• Ferroptosis Antibody Sampler Kit #29650

包含：GPX1 (C8C4) Rabbit mAb #3286，GPX4 Antibody #52455，Thioredoxin 1 (C63C6) Rabbit mAb#2429，Thioredoxin 2 (D1C9L) Rabbit mAb #14907，TRXR1 (D1T3D) Rabbit mAb #15140，TXNIP(D5F3E) Rabbit mAb #14715，Prdx1 (D5G12) Rabbit mAb #8499, Phospho-Prdx1 (Tyr194)(D1T9C) Rabbit mAb #14041, Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody #7074

NETosis 是一种独特的调节性细胞死亡形式，其特征是细胞膜破裂，染色质、组蛋白、颗粒和细胞质成分被挤压成网状结构，称为中性粒细胞胞外陷阱（NETs）。NETosis 被鉴定为对细菌感染的反应，可以通过脂多糖（LPS）以及炎症通路激活剂（如佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA））激活。NETosis可以通过多种通路发生，但已经发现了一些关键作用因素。钙依赖性酶蛋白精氨酸脱亚氨酶 4（Protein arginine deiminase4, PAD4）催化组蛋白的超瓜氨酸化，这有助于染色质凝聚。另外，从细胞质颗粒中释放出嗜中性粒细胞弹性蛋白酶（Elastase, ELANE）和髓过氧化物酶（Myeloperoxidase, MPO）会导致细胞骨架结构的分解和组蛋白的降解。NETosis 的激活也可能在反应性活性氧（ROS）积累之后发生。NETosis 的病理学意义和潜在的治疗作用仍在研究中，但与宿主对病原体的防御以及许多疾病状态有关，包括自身免疫性疾病、血栓形成、心血管疾病和肿瘤进展。

• Myeloperoxidase (E1E7I) XP® Rabbit mAb #14569

从细胞质颗粒中释放中性粒细胞弹性蛋白酶和髓过氧化物酶（MPO）导致细胞骨架结构的分解和组蛋白的降解。

• Neutrophil Elastase (E9C9L) XP® Rabbit mAb #89241

中性粒细胞可释放中性粒细胞弹性蛋白酶、激活促炎性细胞因子并降解细胞外基质的组分，从而在介导炎症反应方面发挥重要作用。

每个通路的复杂性，以及我们对这些过程内交互作用的了解，突显出在鉴定实验中细胞死亡的形式时，需要检查多个参数的重要性。必须研究一种以上的分子通路和细胞死亡标志物，以清晰了解细胞在不同情况下如何死亡。