兼具长读长且准确性高两大特点的PacBio HiFi测序技术突破了二代测序短读长、其他三代测序准确率不足的局限，通过助力研究与早产儿肠道成熟相关的肠道菌群，发现双歧杆菌菌株具有特有的碳水化合物代谢能力，此发现将有助于早期发现和制定早产儿坏死性小肠结肠炎（NEC）的治疗策略。

NEC是引起早产儿死亡的主要疾病。“肠漏症”—肠道屏障通透性高，是NEC发病的主要原因。肠漏症患者肠腔内的细菌和细菌产物能够通过高通透性的上皮细胞屏障转移到外周循环中，广泛侵袭肠上皮细胞和肠固有层，引起黏膜炎症、上皮细胞损伤、肠坏死、全身感染等症状，最终导致多器官衰竭和死亡。NEC是一种典型的与细菌易位相关胃肠道疾病。然而，肠道微生物菌群在上述过程中的作用研究较少。主要是因为测序技术的局限性——基于短读长测序的方法获得16S rRNA V3-V4可变区序列进而评估肠道菌群的分类组成，测序分析结果总是无法准确的追溯到种水平甚至属水平上的分类组成。许多用于扩增16S rRNA V3-V4可变区域的PCR引物无法扩增出双歧杆菌属微生物，而双歧杆菌是早产儿肠道中常见菌种，在肠道发育中发挥有益作用，影响新生儿肠道的成熟，可以通过刺激结肠上皮细胞增生，调节宿主防御反应。所以研究双歧杆菌对预测肠道早期发育成熟具有重要意义。这也是短读长测序无法解决的科学难题。那有没有一种测序方法可以解决这样的技术难点？答案是有的！请往下看

就在2022年6月发表在mBIO杂志上标题为Highly Specialized Carbohydrate Metabolism Capability in Bifidobacterium Strains Associated with Intestinal Barrier Maturation in Early Preterm Infants的文章中作者借助PacBio HiFi 16s rRNA全长测序和宏基因组组装以更高分辨率的分类解析了定殖在早产儿肠道中与肠道成熟相关的微生物菌群。由多种类型微生物组成的肠道菌群中双歧杆菌菌株与肠道屏障通透性具有显著相关性，并具有同化母乳低聚糖和宿主来源糖蛋白的独特遗传能力。

作者研究了113名妊娠在24^0/7到37^6/7周出生的早产儿，收集了517份粪便样本，比较分析了基于短读长测序和长度长测序方法采用16s rRNA测序和宏基因组组装基因组的方案进行高分辨率肠道菌群表征。通过Illumina短读长测序技术对16s rRNA V3-V4可变区进行检测，结果获得25,838,078条高质量、非嵌合的扩增序列变异体(Amplicon Sequence Variants,ASV为聚类的一种方式)，平均长度为428bp，15.3% ASV被定义出种水平；而通过PacBio HiFi 16s rRNA全长测序，共获得1,271,873条高质量ASV，平均长度为1462bp，是短读长获得的序列长度的3.2倍，87.6％的ASV定义了种水平，大大提高了分类分辨率。进一步分析微生物菌群，共定义出6个门15个目212个种。其中肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、大肠杆菌（Escherichia coli）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）和肠杆菌（Enterobacter spp）四个种属占主要地位，存在于86.2 到94.8%的样本中。粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、产气荚膜梭状芽胞杆菌（Clostridium perfringens）、奇异变形杆菌（Proteus mirabilis）、短双歧杆菌（Bifidobacterium breve）和异细孔菌（Veillonella dispar）五个菌属含量次之，存在于47.7% 到86.6%的样本中。

通过分析发现在早产儿复杂的肠道微生物菌群中短双歧杆菌（Bifidobacterium breve）与肠道低通透性显著相关，肠道通透性越低，短双歧杆菌含量越高，双歧杆菌属的菌群含量越高。所以通过PacBio HiFi 16s rRNA全长测序序列构建系统发育树对双歧杆菌属进行种群的进一步分析。其中短双歧杆菌（B.breve）形成了一个单独的进化分支，长双歧杆菌（B. longum）包含四个分支，显示出高度的序列多样性。

图1 用81条独特的全长16S rRNA基因ASV序列构建系统发育树

为了表征双歧杆菌菌种基因组，作者选用了30个样本（菌种中双歧杆菌含量＞10%）基于Illumina短读长测序组装了26个B. breve 和 4个 B. longum 接近完整的宏基因组组装基因组(metagenome-assembled genomes ,MAGs）。基于Pacific Biosciences Sequel II 平台HiFi测序对2个样本进行宏基因组组装，获得了一个完全完整和一个接近完整的的B. breve 菌株。获得的完全完整的菌株基因组大小为2.34 M bp，与NCBI数据库中的菌株（2.33 M）很相近。通过进行泛基因组的分析，鉴定出定殖在具有低肠道通透性特征的早产儿中的B. breve的基因组有46个特异性编码基因，这些基因与糖基转移酶，糖基水解酶，细胞表面粘附和运输，多糖生物合成，群体感应和噬菌体整合功能相关。

最后作者通过进一步分析早产儿发育中的肠道微生物群落、营养和肠道屏障功能之间的复杂相互作用，揭示了足够的母乳喂养量和双歧杆菌独特的碳水化合物代谢能力在出生后改善肠道屏障的关键作用。确定导致肠道发育差异的临床和微生物标志物，将有助于早期发现和制定新的治疗策略，以促进适当的肠道屏障成熟，并预防早产儿的NEC和其他不良健康状况。

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