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【方法推荐】基于PacBio HiFi测序的CYP2D6多态性位点的检测

2022-06-10

导读

细胞色素 P450 2D6，是人体中一种非常重要的代谢酶。编码这一蛋白的CYP2D6是一种高度多态性基因，具有130多种已知变异，包括SNP、重复、缺失和其他类型的多种变异，这些变异会影响人体大约25%的最常用处方药的代谢率。为了对变异进行准确的检测读取，PacBio SMRT测序已被证明是检测CYP2D6变异的有效工具。

今天向各位分享的研究，利用一种简单且经济有效的长扩增子测序方法，形成了一种简化的CYP2D6检测的的完整工作流程，利用PacBio长而准的HiFi测序检测高度多态性的CYP2D6变异位点。本研究表明，HiFi测序能够生成CYP2D6等位基因的全长序列，并实现准确的二倍型读取。

材料与方法

图1. CYP2D6测序的端到端工作流程。

其中采用两步法PCR进行扩增的方案为：

在第一轮PCR反应中，使用带有M13序列的靶向基因扩增引物，对上游的重复序列，下游的CYP2D6基因，以及*5等位基因（完全缺失）进行特异性扩增。（扩增结构可见图2）
在第二轮PCR反应中，用含有M13序列的Barcode引物，对上述扩增子再进行进一步扩增，为不同样本来源的扩增子标记相应的barcode。

图2. 连接M13序列的靶向引物所扩增的片段。红色箭头，用于扩增*5等位基因的引物；绿色箭头，用于扩增上游重复序列的引物；黄色箭头，用于扩增下游CYP2D6基因的引物。

图3.两步法PCR原理示意图。

该项目对22份来自Coriell研究所的药物基因组参考样本进行CYP2D6变异检测。

将标记好barcode的扩增子集中混样，进行一次SMRTbell文库构建，然后在PacBio Sequel Il或Ile 系统上进行测序。

测序完成后，采用SMRTLink 对所获得的HiFi reads（>QV20）进行barcode拆分，并使用bioconda^#的“pbaa”扩增子分析流程得到每个单倍型的一致序列，并确定CYP2D6二倍型。

^#https://github.com/PacificBiosciences/pbAA

图4. 每个样本中，不同扩增所占各自HiFi reads的比例(例如，NA17276有72%的reads为*5等位基因（完全缺失），28%的reads为正常的8.1 kb大小的等位基因)。22个Coriell样品中，>99%的HiFi reads都靶向了CYP2D6。

图5. 两步法扩增子用自动化脉冲场电泳Femto Pulse进行片段化大小分析质控的结果。

图6. 对41份人唾液样本进行了两步PCR检测。从41个样本中得到的扩增子具有特异性。

表1. Coriell参考样本的二倍型读取。

讨论

通过图5与图6两种不同来源样本的扩增子电泳图比较，2步PCR靶向扩增的方法，用于检测CYP2D6，无论是来自Coriell参考样本还是一般的唾液样本，都有着比较稳定表现，能够特异扩增靶向序列。
Coriell样品NA17217中，通过HiFi测序检测到一个解析为*33/*41的SNP，然而，在之前微阵列芯片的方法检测所注释的是*1/*41（见表1中，红色方框）。
同样，在NA17232样本中检测到一个SNP，HiFi测序的结果显示*2/*2xN，但在过去其他的方法检测为*2x2/*35（见表1中，蓝色方框）。
在4个样本(NA16654、NA16688、NA17209和NA17226)中， HiFi测序发现了重复序列(*36等位基因)，而微阵列和real-time PCR检测不到（见表1中，绿色方框）。

结论

PacBio提供了从PCR靶向富集，Barcode混样到二倍型读取的完整流程，用于表征CYP2D6变异。
HiFi测序所获得的数十kb，且质量≥QV30的高质量reads，足以对CYP2D6的多个扩增子进行完整的靶向测序与分析。
HiFi测序单碱基水平的分辨率揭示了其他技术无法检测到的二倍型。

参考文献：

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[7]Qiao, W., et al. (2019). Integrated CYP2D6 interrogation for multiethnic copy number and tandem allele detection. Pharmacogenomics, 20(1), 9-20.

基因有限公司作为PacBio公司在中国区的独家代理商，自2011年以来将PacBio第三代单分子实时测序技术引入国内，一直为国内用户提供专业的三代测序系统的安装培训，技术支持，应用培训与售后维护工作，赢得客户的一致好评与信任。基因有限公司将一如既往的支持越来越多的PacBio用户。