C9orf72的重复扩张是全世界额颞叶痴呆（Frontotemporal disorders，FTD）和肌萎缩性侧索硬化症（Amyotrophic lateral sclerosis，ALS，即渐冻症）的最常见遗传原因。越来越多的研究表明这种扩增与许多神经系统疾病相关，例如帕金森症，在没有家族病史的神经退行性疾病患者中也发现了这种扩增突变。所以随着疾病治疗试验的开展，与C9orf72相关疾病的早期诊断变得越来越重要。

引起神经退行性的C9ofr72突变主要是由位于2个转录起始位点之间的GGGGCC（G4C2）六核苷酸序列异常重复扩增所致， 健康的个体通常携带该重复序列数目低于30个，而患有C9orf72相关疾病的个体通常具有数百至数千个重复序列。有关C9orf72重复长度与临床特征的研究由于检测和确定扩增的技术难度而受到阻碍。

以下发表于Molecular Neurodegeneration

的研究，使用长度长测序技术，旨在揭示C9ofr72 G4C2重复序列突变的特点。

最初基于重复序列克隆到质粒中的测序分别在PacBio RS II和ONT MinION平台进行。

实验中以不含重复序列的EGFP质粒作为对照；以SCA36质粒为第二对照（含有重复序列且GC含量比C9orf72 G4C2低1/6），实验组则将目标区域分别克隆进两个质粒C9-432和C9-774。

用于测试PacBio和ONT长读测序技术的质粒示意图

质粒测序流程示意图

作者比较了两个平台对C9-774的测序结果来评估测序精度，将单个reads的重复区域对准相同长度的期望重复序列后，使用全局Needleman-Wunsch算法，C9-774的PacBio RS II中位错误率为7.4%，而的ONT MinION中位错误率为47.3%。PacBio RS II共识序列在C9-774质粒中包含774个重复，准确率约为99.8%。ONT MinION共识序列在C9-774质粒中也包含774个重复，但准确率仅仅约26.6%，许多鸟嘌呤和胞嘧啶被错误地读取为腺嘌呤。因此，在ONT MinION一致序列中，鸟嘌呤和胞嘧啶被表示为混合核苷酸(例如，R代表G或A, M代表C或A)。774个ONT MinION重复序列中有553个(71.4%)被表示为rrrcm或RRRRMC。

作者后续使用PacBio Sequel平台和ONT MinION平台对有重复扩增现象的病人小脑进行了全基因组测序。

最终通过PacBio测序技术，仅用5张SMRT Cell 1M芯片就获得了大约7X全基因组中位覆盖度、C9ofr72重复位点8X的覆盖度的数据，准确地报告了8个重复的未扩展等位基因和1324个重复(7941个核苷酸)的整个扩展序列。而在Min ION的15个 flow cells上只获得了3X全基因组中位覆盖度和C9ofr72重复位点2X 的覆盖度，在仅有的两个C9orf72 reads中都没能完全覆盖扩张的重复位点。

使用graphma比对PacBio Sequel生成的全基因组数据和人类参考基因组hg38

为了提升测序的覆盖度和降低成本，研究者后续又在PacBio平台利用基于Crispr/Cas9技术的非扩增靶向测序对C9orf72重复位点进行读取，获得了大于800×的覆盖度。识别了70%未扩展的、含有2个G4C2重复的等位基因和16%扩展了的序列，扩展序列有两种，分别是110次重复和870次重复，说明重复位点有两种嵌合模式。

无扩增靶向富集的建库流程

相关文献：

Ebbert, Mark TW, et al. "Long-read sequencing across the C9orf72 ‘GGGGCC’repeat expansion: implications for clinical use and genetic discovery efforts in human disease." Molecular neurodegeneration 13.1 (2018): 1-17.