JAMA | Covaris R230助力自动化快速WES揭示COVID-19重症病人免疫缺陷

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JAMA | Covaris R230助力自动化快速WES揭示COVID-19重症病人免疫缺陷

2022-03-07

高通量NGS测序文库的构建是一项十分耗时耗力的工作，需要熟练的科研技术人员在整个操作过程中保持高度注意力，花费大量时间和精力才能完成。因此，自动化文库构建是工业级高通量NGS 发展的必要条件，可以节省人力、减少人为操作误差，实现快速、高通量、高质量的文库构建。酶法是自动化的一个选择，但是有一些临床样本来源复杂，其浓度、体积和缓冲液组成等方面都存在差异，有研究表明，对这类样本进行DNA酶解片段化时，部分样本可能存在偏好性。

Covaris公司新推出的R230桌面式聚焦超声系统将为工业级NGS文库制备提供真正的无偏好自动化解决方案。

R230文库制备特点

适用各种样本类型

血液、唾液、羊膜、绒毛膜、细胞系、组织和FFPE

剪切体积灵活

5至50 μL，且无最低DNA上样量要求

微量样本处理

允许在一个管中制备文库，减少转移步骤，更大限度地减少样品损失，是理想的处理珍稀临床和痕量样品的方式

兼容性

允许同一批次处理不同浓度和缓冲类型的样品；AFA-TUBE TPX耗材符合ANSI sla板材标准，并与大多数热循环器和金属浴兼容

标准化和可靠的剪切

聚焦超声方法(AFA)能量精确可控，剪切稳定，减少QC步骤，消除了批次与批次之间的差异

高通量

96/384孔板的高通量处理，减少动手时间，并允许对接自动化液体工作站

样本追踪

自动化的工作流程从头至尾追踪样本，减少了潜在的人为错误

应用

实例

Covaris R230整合Hamilton STARplus

荷兰内梅亨大学医学中心人类遗传学系基因组诊断部门，简称内梅亨基因组技术中心(The Radboud Genome Technology Center，RGTC) 负责内梅亨大学医学中心(Radboud University Medical Center)的所有临床基因检测。是荷兰8个UMC基因检测中心之一，并获得了荷兰认证委员会(RvA)的ISO 15189认证。在2010年底，RGTC成为第一个在临床环境中使用全外显子组测序(WES)的实验室，自那以后，RGTC进行了超过45,000个临床外显子组测序，建立了基因检测的新标准。2017年，RGTC首次建立了一个快速WES工作流程，为重症新生儿患者提供一个周期为5到7天的快速诊断。

RGTC

RGTC 将Covaris R230聚焦超声系统与液体处理装置Hamilton STARplus相结合，建立了具有高质量测序性能的自动化文库制备平台。实现了手动工作流程向自动化文库制备转变。使用这种自动化文库制备工作流程，RGTC已经能够通过增加样本通量来扩大其临床快速WES服务，保持患者报告的周转时间为5到7天。

R230聚焦超声仪与Hamilton STARplus实现自动化整合

基于以上自动化文库构建工作流程，内梅亨大学医学中心2020年发表了利用快速WES技术，揭示COVID-19重症病人免疫缺陷的相关研究。

本文的科学问题在于：感染了新冠病毒后，为什么有些人会发展为重症，而有些人不会？新冠重症患者中有许多都是无既往病史的青年男性，因此作者猜测这些重症患者可能存在原发性免疫缺陷，易受SARS-CoV-2引起的严重感染。

为了证明COVID-19年轻男性患者中有原发性免疫缺陷相关的基因变异的存在，作者研究了两个家庭，这两个家庭中都有年轻男性（平均年龄为26岁，年龄范围21-32岁）感染新冠病毒，并发展为重症出现呼吸窘迫需要ICU监护，其中还出现了一例重症患者死亡。作者对这两个家庭成员的PBMC进行了快速全外显子测序。

两个家庭的谱系图

所有DNA样本均使用Covaris R230聚焦超声系统进行剪切，随后在Novaseq 6000仪器(Illumina)上进行2×150个碱基对双端(Paired-end)测序。

测序结果发现，两个家系的X染色体上的TLR7是两个家族中生物学上最可信的候选基因，在家族1的患者II-1中，发现了一个4核苷酸半合子缺失，导致TLR7功能完全丧失。该缺失在家族1的已故兄弟II-2中也被检测到，在家族1的携带者母亲I-2中是杂合的。在家族2的患者II-1中，发现了一种被预测是有害的错义突变，该突变会导致氨基酸改变，影响富含亮氨酸重复区域-羧基末端结构域，这是一种高度不耐受的变异。分离分析证实，在II-1的兄弟II-2中也存在相同的错义氨基酸变化。

TRL7在两个家族中基因和蛋白水平的突变示意图

随后作者又证实了以上两种突变的存在会使COVID-19重症病人PBMCs细胞在面临TLR7激动剂处理时，其mRNA表达不能被激活，且TLR7通路中I型IFN相关基因IRF3、IRF7、ISG15、IFNB1 的mRNA表达也不能有效激活。不仅如此，TLR7激动剂处理也不能在患者中产生IFN-γ（II 型IFN）。

研究表明，TLR7已被证明在对抗冠状病毒的先天免疫反应中具有直接功能。TLR7在MERS和SARS的ssRNA识别中是一个重要的模式识别受体，而以上研究利用快速WES发现了TLR7这一候选基因，并确定了其为COVID-19中I型和II型IFN应答的诱导剂。这些初步发现为了解COVID-19的发病机制提供了依据，也为后续研究COVID-19的ssRNA识别受体提供了一些新的思路。

文献链接：van der Made, Caspar I et al. “Presence of Genetic Variants Among Young Men With Severe COVID-19.” JAMA vol. 324,7 (2020): 663-673. doi:10.1001/jama.2020.13719

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