单细胞RNA Seq即单细胞转录组测序，是在单细胞水平上对转录事件进行分析的技术，可以研究单个细胞内的基因表达及可变剪切。NGS是单细胞转录组分析的重要技术基础，NEB已经有单细胞转录组测序的完整方案，即合成单个细胞全长cDNA，并对cDNA进行NGS建库用于NGS转录组测序。但受限于二代测序读长短的问题，转录的可变剪接不能很好的解析。整合全长cDNA的PacBio SMRT建库并进行SMRT测序，单细胞IsoSeq(scIso-Seq)为解析单个细胞基因转录的可变剪切提供了技术支撑。

    lain C Macaulay等在2015年发表在Nature methods的题为“G&T-seq: parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes”的文中，利用单细胞挑选结合单细胞Iso-Seq的方法解析了基因融合，验证了在乳腺癌细胞中发现的一种与癌症有关的染色体融合，并鉴定了发生融合的具体位点。该技术有助于更深入的理解正常组织和疾病组织之间的遗传学差异，为人们提供正常发育和疾病发展的新线索，例如可以通过G&T-seq更好的理解肿瘤细胞多样性。

具体实验流程如下：

乳腺癌细胞中的染色体融合：

      通过单细胞的PacBio全长转录本测序技术Iso-Seq，验证了来自乳腺癌细胞中的全长融合转录本MTAPPCDH7，该融合转录本由MTAP的1-6号外显子与PCDH7的3、4 、6号外显子连接融合组成。

       除单细胞转录组学外，挑选特异单细胞后结合一步法RT-qPCR也是比较常用的低成本的单细胞转录学研究技术。Lapin等于2017年在BMC Cancer上面发表的“Single-cell mRNA profiling reveals transcriptional heterogeneity among pancreatic circulating tumour cells”一文中使用MMI CellEctor自动化单细胞挑选系统结合一步法RT-qPCR技术分析单细胞基因表达，确定了CTC不同的亚群，并揭示了与CTC向远端器官部位转移相关的转录本表达升高。

胰腺癌CTC单细胞挑选及基因表达分析流程：

1.收集21位胰腺癌病人化疗前后多个时间点血样。

2. 利用Lymphoprep™密度梯度离心法得到单核细胞，采用磁珠阴性筛选的方法去除表达CD45, CD16, CD19, CD163和 CD235a/GYPA的淋巴细胞。

3.对可能的CTC细胞进行荧光染色Hoechst 33342、 antibodies EpCAM-FITC、MCAM-FITC和CD45 DyLight550。

4.利用MMI CellEctor可视化自动挑选单个CTC细胞。

5.单细胞RT-qPCR分析CTC细胞EpCAM、CDH2、 CD24等13个基因的转录表达。

CellEctor挑选出单个胰腺癌CTC：

如上图所示，用MMI CellEctor可视化自动挑选出细胞核（Hoechst 33342）可见，以及肿瘤生物标志物（EpCAM-MCAM）阳性和CD45阴性的细胞进行下游分析。

RT-qPCR结果：

通过聚类分析确定胰腺癌CTCs存在上皮样和间充质样两个亚群。CTC-E细胞markerCD24高表达, CTC-M细胞外间质蛋白SPARC（胰腺癌基因）高表达。这些转录本的差异影响CTC细胞的亚型，很可能与胰腺肿瘤细胞的转移相关。

MMI CellEctor单细胞挑选系统

系统特点✦

参考文献：

1:Iain C Macaulay.et al.G&T-seq: parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes.Nature methods 12.6 (2015): 519-522;

2:Lapin et al. Single-cell mRNA profiling reveals transcriptional heterogeneity among pancreatic circulating tumour cells. BMC Cancer (2017) 17:390.

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1.单细胞蛋白组学方案

2.空间蛋白组学方案

3.稀有、罕见单细胞挑选利器—CellEctor单细胞挑选系统