“酶”处理染色质免疫沉淀(琼脂糖微珠)的组织样本操作方法

转自CST 中国 CST博士互助平台

所需试剂

包含在试剂盒SimpleChIP® PlusEnzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9004中的试剂：

a.    甘氨酸溶液(10X)#7005

b.    缓冲液 A(4X) #7006

c.    缓冲液 B(4X) #7007

d.    ChIP缓冲液(10X) #7008

e.    ChIP 洗脱（缓冲）液(2X) #7009

f.     5 M NaCl#7010

g.    0.5 M EDTA#7011

h.    ChIP级蛋白G琼脂糖微磁珠 #9007

i.      DNA结合缓冲液#10007

j.      DNA漂洗缓冲液（使用前添加4倍体积无水乙醇）#10008

k.     DNA洗脱缓冲液#10009

l.      DNA纯化柱#1001036个

m.  蛋白酶抑制剂混合物 PIC(200X) #7012

n.    RNase A (10 mg/ml) #7013

o.    微球菌核酸酶(2000 gel units/μl) #10011（用来切割染色质的关键酶）

p.    蛋白酶K(20 mg/ml)#10012

q. SimpleChIP™ 人 RPL30（Exon 3）阳性对照引物#7014

r. SimpleChIP™ 小鼠 RPL30 （Intron 2）阳性对照引物#7015

s.     组蛋白H3(D2B12) XP™ 兔单抗 (ChIP 专用) #4620

t.     正常兔IgG#2729

u.    #7016，DTT粉末，192.8mg,（4°C保存，溶解后-20°C保存）

不包含在试剂盒SimpleChIP® PlusEnzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9004 中的试剂：

a.    甲醛（37%）（福尔马林）

b.    乙醇（96-100%）

c.    1X PBS ＃9872

d.    无核酸酶水 ＃12931

e.    Taq DNA聚合酶

f.     dNTP 混合液

I.      组织样品交联与样品制备

当收取组织样品进行ChIP实验时，要尽量去除脂类，以及坏死等无关组织。组织样品可直接进行交联处理，或置于干冰上稍后处理。为了获得更优的ChIP结果，推荐一个标准的ChIP反应需要约25mg组织样品处理后获得的染色质。而不同组织类型中的染色质含量有差异，为获得适量的染色质样品可根据预实验结果适当调组织用量。请参考附表A，查询不同类型的组织样品中的预期染色质量。

在实际工作当中，我们建议每次实验处理足量的细胞用于满足后续多个免疫沉淀反应（如使用不同靶标蛋白抗体进行免疫沉淀，阴性对照（IgG）组，阳性对照组等）和技术性重复要求。您可根据自己的实验设计，在开始实验前计算所需要的ChIP反应次数，准备相应足量的组织或细胞。例如，对于一个标准体系的单次ChIP实验（包括1个实验组样品和1个对照组样品，分别进行1个目的蛋白抗体，阴性对照IgG，阳性对照H3抗体的3个ChIP反应）。

注意：预实验时，需要额外准备一个细胞样品，对染色质样品酶解效率和浓度进行检测。

实验前准备

·         足量组织样品（请根据自己的实验需求，计算所需要的ChIP反应次数所需样品量）

·         取出并预热200X蛋白酶抑制剂混合物PIC＃7012和10X 甘氨酸溶液＃7005，确保PIC完全溶解。

·         配制1M DTT溶液。具体地，192.8 mg DTT#7016+ 1.12ml dH₂O，确保DTT完全溶解。

注意：一旦配好DTT溶液，请保存于-20°C。

·         准备预冷的PBS，用于洗涤组织。

·         配制含PIC的PBS，每25mg 组织准备3 ml PBS （加入15 μl 200X PIC） ，置于冰上冷却。

·         每25mg 组织准备 45 μl 37%的甲醛溶液，置于室温，确保新鲜未过期。

A. 交联

1.        称取新鲜或冻存的组织样品，每个IP反应按需25mg计算。

2.        把样品置于60 mm 或100 mm 培养皿中，用解剖刀和剪刀剪碎。并保持样品一直处于冰上或低温，避免蛋白降解。

3.        转移切碎的组织到15 ml 的锥底管中。

4.        按样品量，每25 mg 样品添加1 ml PBS＋PIC。

5.        为了使蛋白与DNA交联，每25 mg 样品（1 ml PBS＋PIC）加入45 µl37%的甲醛溶液（根据样品量调整，保证甲醛终浓度为1.5%即可）。室温下低速摇动20分钟。

6.        每25 mg 样品（1 ml PBS＋PIC）加入100 µl 10X 甘氨酸溶液稍加转动使之混匀，室温孵育5分钟，来终止上述固定反应。

7.        4°C, 1500 rpm离心5分钟收集固定后的组织样品。

8.        去除上清后，用1 ml 冰冷的PBS＋PIC（每25 mg样品）漂洗样品一次。

9.        4°C, 1500 rpm，再次离心5分钟， 

10.      去除上清后，重悬样品到1 ml PBS＋PIC（每25 mg样品）并置于冰上。使用Medimachine组织样本制备仪（B部分）或者Dounce匀浆器（C部分）把组织样品分解成单细胞悬液。

B．使用Medimachine组织样本制备仪（BD公司，#340587）分解组织样品

1.        准备末端切开的1000 µl枪头若干，用于转移组织样品块。

2.        取1 ml重悬于PBS＋PIC的组织样品，置于组织样本制备仪顶部的50 mm槽中（＃340592部分）。

3.        按照仪器说明书研磨样品2分钟。

4.        用装有18号针头的1 ml注射器把细胞悬液从组织样本制备仪底部槽中转移到15 ml锥底管中，并置于冰上。

5.        重复上述2-4步，直到所有组织被处理成单一细胞悬液。

6.        如研磨不彻底，可添加少量PBS＋PIC后，重复2-5步直到所有组织被处理成单一细胞悬液。

7.        显微镜下观察确认样品为单一细胞悬液（可选步骤）。

8.        4°C, 1500 rpm离心5分钟收集细胞。

9.        去除上清后立即进行后续的细胞核处理和染色质剪切（参照第III部分）。

C．Dounce 匀浆器分解组织样品

1.        转移重悬于PBS＋PIC的组织样品到Dounce匀浆器中。

2.        研磨分解样品20-25次，显微镜下观察确认样品为单一细胞悬液（可选步骤）。

3.        转移样品到15 ml锥底管中，4°C, 1500 rpm离心5分钟收集细胞。

4.        去除上清后立即进行后续的细胞核处理和染色质剪切（参照第III部分）。

II.     细胞交联与样品制备 

为了获得更优的ChIP结果，一个标准的ChIP反应需要约4X 10⁶个细胞处理后获得的染色质，以Hela细胞为例， 375px培养皿，90%生长密度下的细胞量约为8X 10⁶个细胞。在实际工作当中，我们建议每次实验处理足量的细胞用于满足后续多个免疫沉淀反应（如使用不同靶标蛋白抗体进行免疫沉淀，阴性对照（IgG）组，阳性对照组等）和技术性重复要求。您可根据自己的实验设计，在开始实验前计算所需要的ChIP反应次数，准备相应足量的组织或细胞。例如，对于一个标准体系的单次ChIP实验（包括1个实验组样品和1个对照组样品，分别进行1个目的蛋白抗体，阴性对照IgG，阳性对照H3抗体的3个ChIP反应）。因此，以Hela细胞样品为例，如下表所示：

注意：建议在开展正式实验前，先进行下预实验，以熟悉实验体系和了解并优化所用样本的各项条件。预实验时，需要额外准备一个细胞样品，对染色质样品酶解效率和浓度进行检测（（参照第IV部分））。

另外，为了细胞计数，可另外准备一盘细胞用于血球计数板法测定细胞数。

实验前准备

·         足量培养的细胞（请根据自己的实验需求，计算所需要的ChIP反应次数和培养细胞量）

·         取出并预热200X蛋白酶抑制剂混合物PIC＃7012和10X 甘氨酸溶液＃7005，确保PIC完全溶解。

·         配制1M DTT溶液。192.8 mg DTT #7016+1.12ml dH₂O，确保DTT完全溶解。

注意：一旦配好DTT溶液，请保存于-20°C。

·         准备预冷的PBS，用于洗涤细胞。

·         配制含PIC的PBS，用于刮下和收集细胞。每15 cm培养皿需要2ml PBS（加入10μl 200X PIC） ，置于冰上冷却。

1.        为了使蛋白与DNA交联，向每个含有20 ml培养基的15 cm培养皿中加入540 µl 37%的甲醛溶液（可根据培养基体积调整，保证甲醛终浓度为1%即可）。稍加转动培养皿使之混匀，室温放置10分钟。加入甲醛后，培养基的颜色会发生改变。

2.        每个15 cm培养皿中加入2 ml 10X 甘氨酸溶液稍加转动使之混匀，室温孵育5分钟，来终止上述固定反应。加入甘氨酸后，培养基的颜色会发生改变。

3.        对于悬浮细胞，收集固定后的细胞到50 ml锥底管中，4°C1500rpm离心5分钟沉淀细胞后，用冰冷的PBS漂洗两次（20 ml /次）。去除上清后立即进行后续的细胞核处理和染色质酶解（见第II部分）。

4.        对于贴壁细胞，弃去培养基后用冰冷的普通PBS漂洗两次（20 ml/次），每次彻底弃净PBS。

5.        每15 cm培养皿的细胞量加入2 ml冰冷的含PIC的1X PBS，将细胞刮下，并将所有交联固定后的细胞收集到一个15 ml的锥底管中。

6.        4°C，1500rpm离心5分钟收集细胞，去除上清后立即进行后续的细胞核处理和染色质剪切（参照第II部分）。

III.    细胞核处理和染色质剪切

注意：以下操作流程针对单个IP反应（4X 10⁶细胞或25 mg 组织）给出所需试剂用量。我们建议同一样品组内的多管样品（用于不同抗体的ChIP沉淀反应需要）染色质处理过程可合并至一管进行，这有利于得到均一的染色质酶解和超声效果，使用者需根据每组需要的ChIP反应总数调整试剂用量。

实验开始前准备：

·         取出并预热200X蛋白酶抑制剂混合物PIC＃7012，确保PIC完全溶解。

·         1 M DTT（192.8 mg DTT #7016 + 1.12ml dH₂O），确保DTT完全溶解（溶解后－20°C保存）。

·         预热10X ChIP缓冲液#7008，确保其中SDS完全溶解。

针对单个IP反应，准备如下试剂：

·         每4X 10⁶细胞或25 mg组织，准备100 µl 1X ChIP 缓冲液 （10 µl 10X ChIP 缓冲液#7008 + 90 µl 水） + 0.5 µl 200X 蛋白酶抑制剂混合物（PIC），冰上预冷。

·         每4X 10⁶细胞或25 mg组织，准备1 ml 1X 缓冲液A（250 µl4X缓冲液A #7006+ 750µl 水）+ 0.5 µl1 M DTT + 5 µl 200X蛋白酶抑制剂混合物（PIC），冰上预冷。

·         每4X 10⁶细胞或25 mg组织，准备1.1 ml 1X 缓冲液B（275µl 4X缓冲液B#7007 + 825µl 水）+ 0.55µl 1 M DTT，冰上预冷。缓冲液B中切勿加入PIC。

1.        每4X 10⁶细胞或25 mg组织重悬到预冷的1 ml 1X缓冲液 A + DTT + PIC中，冰上孵育10分钟，每3分钟颠倒混匀一次。

2.        4°C 3000rpm离心5分钟以沉淀细胞核。弃上清，每4X 10⁶细胞或25 mg组织的沉淀重悬在1 ml冰冷的缓冲液B + DTT中。再次离心，弃上清。将沉淀用100 µl 缓冲液 B + DTT再次重悬（此时同一样品组内的多管样品可合并至一管一起进行后续的酶解，超声处理，将同组样品转移到一个新的1.5 ml离心管中）。

3.        加入适量（一般起始量为0.5ul/每4X 10⁶细胞或25 mg组织）微球菌核酸酶，颠倒混匀数次，37°C孵育20 min，每隔3~5分钟颠倒混匀一次，将DNA消化成长度约为150-900 bp的片段。

注意：可通过预实验确定将不同细胞系DNA酶切到理想长度所需微球菌核酸酶的酶量（参照附录B），其中4 ×10⁶个HeLa细胞核经0.5 µl微球菌核酸酶＃10011消化可以得到合适长度的DNA片段。

4.        每4X 10⁶细胞或25 mg组织，加入10 µl 0.5 M EDTA终止消化，将离心管置于冰上。

5.        4°C 13000rpm离心1分钟，沉淀细胞核。弃上清。

6.       每4X 10⁶细胞或25 mg组织的细胞核沉淀重悬在100 µl 1X ChIP 缓冲液 + PIC中，冰上孵育10分钟。 可用带有剪去前端部分的枪头的移液器吹打均匀。

7.        对细胞核样品用超声波处理数次以破碎核膜（将合并后的同组样品超声体积控制在500 µl左右，若原体积不足500ul，可用1X ChIP 缓冲液补足到500ul，可获得更优的超声效果）。CST推荐使用更大功率为100W左右的超声破碎仪进行超声处理，使用3mm的探头，设置超声功率为更大功率的30%-40%，对细胞核进行每次20秒，共3次（累计60秒超声）的超声处理以达到完全破碎的效果。每次超声处理间隔 30秒并放置冰上以防止超声引起样品过热。另外，可以在超声前后分别把细胞核悬液滴于载玻片上，用盖玻片封片后利用光学显微镜观察细胞核以判断完全破碎细胞核所需的更佳条件。或者也可以用杜恩斯型（Dounce）匀浆器处理细胞核20次，但是这种破碎效果可能不如超声处理完全。

8.        4°C 10000rpm离心10分钟，除去样品中的细胞核碎片。

9.        将上清转移到一个新管子中，即为交联的染色质样品。在下一步使用之前需要保存在-80°C。取50 µl染色质样品用以分析DNA的酶切情况并确定其浓度（参照第IV部分）。

IV.   分析染色质的浓度和酶切情况（推荐步骤）

1.        向50 µl染色质样品（来自第I部分第9步）添加100 µl无核酸酶水，然后加入6 μl 5 M NaCl #7010和 2 μl RNase A #7013。涡旋震荡混匀，37°C孵育30分钟。

2.        向RNase A消化后的样品中加入2 μl 蛋白酶K。涡旋震荡混匀， 65°C孵育2小时。

3.        按照第VII部分的说明利用离心柱纯化DNA。

4.        DNA样品纯化后，取15 µl进行1%琼脂糖凝胶电泳（使用100 bp DNA ladder作为Marker）以确定DNA片段大小。DNA应当被酶切成长度约为150-900 bp的片段（1~5个核小体长度）

5.        测定DNA浓度时，将2 µl纯化后的DNA加入到98 µl TE缓冲液中（即稀释50倍），然后读取并记录DNA浓度。并乘以50来计算原管中的DNA浓度，理想的DNA浓度应当在50~200 μg/ml之间。

注意：要得到理想的ChIP结果，合适长度和浓度的染色质样品至关重要。过度消化可能会减弱PCR定量信号。而消化不足可能会导致过高的背景信号并降低分辨率。加入到IP体系中的染色质太少也可能导致不能产生PCR定量信号。优化染色质消化条件的操作方法请参照附录B。

V.     染色质免疫沉淀

为了得到理想的ChIP结果，每个IP反应需要含有5-10 µg DNA的交联染色质片段。一般在与抗体孵育前，需要根据样品染色质浓度计算体积后分至新的不同EP管中，并分别用1X ChIP缓冲液补齐到500 µl。

实验开始之前准备：

·         取出并预热200X蛋白酶抑制剂混合物PIC＃7012。确保PIC完全溶解。

·         预热10X ChIP缓冲液#7008，确保其中SDS完全溶解。

·         交联的染色质样品。

·         低盐漂洗液：每个IP反应预备 3 ml 1X ChIP 缓冲液 (300 µl 10X ChIP 缓冲液 + 2.7 ml 水)，使用前室温保存。

·         高盐漂洗液：每个IP反应预备1 ml 1X ChIP 缓冲液 (100 µl 10X ChIP 缓冲液 + 900 µl 水) + 70 µl 5M NaCl #7010，使用前室温保存。

·         在确定免疫反应数时，每一个组内应考虑计算包括目的蛋白抗体管（可能为多种不同目的蛋白抗体，根据抗体种类数确定）和阴性对照管抗体正常兔IgG #2729的反应数。同时，对于初次进行ChIP实验的用户，我们推荐每组加一个阳性对照管，后续使用试剂盒内提供的#4620抗体进行ChIP反应。

·         在配好的ChIP缓冲液中，每个反应管加入等量交联后的染色质样品（每管对应5~10ug的染色质DNA，来自第III部分第9步），每个沉淀反应需要用1X ChIP缓冲液补齐到500 µl（需要补加的体积根据每管分装的染色质体积确定），并补加适量的200X PIC，混匀后置于冰上。

·         将稀释后的ChIP染色质，每个样品吸取10 µl样品并转移到一个新的离心管中，作为2%样品输入对照（Input），在后续使用之前可以保存在-20°C (Input样品后续用于第VI部分的第1步)。

·         在各个样品管中加入对应的目的蛋白抗体，在每组阴性对照管中加入IgG。每种抗体做免疫沉淀时所需用量在1~2 µg，具体浓度请联系CST技术支持查询，并需要和阴性对照正常兔IgG #2729抗体用量保持一致。IgG浓度较高，加入1~2ul即可。对于本试剂盒自带阳性对照组蛋白H3 (D2B12) XP™ 兔单抗#4620，加入10 µl即可。将加入抗体的反应管封严，在4°C的转子上孵育4小时以上或过夜。

·         轻微重悬混匀ChIP级蛋白G琼脂糖微珠 #9007，取30 μl加入到每个免疫沉淀反应中，重新封严管子，4°C的转子上孵育2小时。为了防止在吸取微珠时枪头将微珠损伤，可以在吸取微珠前将100ul枪头用剪刀减去前端一小部分使用。注意：ChIP级蛋白G琼脂糖微珠 #9007因存在使用鲑精DNA封闭问题，故不适用于后续ChIP-Seq检测。

·         4°C 6000rpm，离心1分钟，沉淀每个样品中的蛋白G琼脂糖微球，并除去上清。此上清可以暂时保留，以备查找问题时使用。

·         加入1 ml低盐漂洗液，在4°C转子上转动并孵育5分钟。再重复上述6和7步骤2次，即总共用低盐漂洗液洗3次。

·         加入1 ml高盐漂洗液，在4°C转子上转动并孵育5分钟。然后小心地将上清吸走，然后立即进入第VI部分。

VI.   将染色体从抗体/蛋白G微珠上洗脱并解交联

实验开始之前准备：

·         从冰箱中取出并在37°C水浴中预热2 X ChIP洗脱缓冲液#7009并确认SDS已完全溶解。

·         将水浴锅或温控混匀器设定到65°C。

·         为各个样品管（包括阴性对照IgG管）洗脱下来的样品和2%的样品输入对照（2% Input）准备1 X ChIP洗脱缓冲液。每管需要75 µl 2 X ChIP洗脱缓冲液#7009 + 75 µl 水，需要的1 X ChIP洗脱缓冲液总量依据总管数+input数来计算。

以下步骤均针对每个样品管来描述：

1.        取150 µl 1 X ChIP洗脱缓冲液分别加入到每组对应的2%样品输入对照（2% Input）管中，室温放置直到第6步。

2.        在其他每份ChIP免疫沉淀样品中分别加入150 μl 1 XChIP 洗脱缓冲液。

3.        用涡旋混合器轻轻震荡（1200rpm），65°C孵育30分钟将染色质从抗体／蛋白G微球上洗脱下来。此步用金属温控振荡器（即带有振荡功能的金属浴）效果更好。当然，洗脱也可以在室温下的转子上进行，但洗脱效果可能不如温控振荡器完全。

4.        4°C 6000rpm，离心1分钟，沉淀每个样品中的蛋白G琼脂糖微球，并除去上清。

5.        小心地将每个样品管中洗脱下来的染色质上清转移到一个新的离心管中，并分别标记。

6.        在所有管中，包括第一步的2%样品输入对照（2% Input）管，都加入6 µl 5 M NaCl和2 µl 蛋白酶K#10012并在65°C孵育2小时。

7.        可直接进入第VII部分，或者可保存样品在-20°C，暂停操作。为了避免在低温形成沉淀，在第VII部分第一步开始添加DNA结合液前，需确保样品回复室温。

VII.  离心柱纯化DNA

实验开始之前准备：

·         向DNA漂洗缓冲液＃10008 添加4倍体积96-100%乙醇。

·         为V部分得到的每一个DNA样品准备一套DNA离心柱和收集管。

1.         向每个DNA样品中添加750 µl DNA结合缓冲液#10007，涡旋混匀器稍加震荡。即每一份的样品需要添加五倍体积的DNA结合缓冲液。

2.        将DNA离心柱插入到收集管中并做标记，每个样品先吸取450 µl分别转移到各自的离心柱中。

3.        室温14000rpm离心30秒。

4.        把离心柱从收集管中取出，倒掉废液后，将离心柱重新插回到收集管中。

5.        将第1步中剩余的450 µl样品再转移到相应的离心柱中，重复第3和第4步。

6.        在每个离心柱中加入750 µl的DNA漂洗缓冲液#10008。

7.        14000rpm离心30秒。

8.        把离心柱从收集管中取出，倒掉废液。将离心柱插回到收集管中。

9.        14000rpm离心30秒。

10.      取出每个样品对应的离心柱，分别插入到一个干净的1.5 ml离心管中，并做好标记，将收集管和废液一起丢弃。

11.      在每个离心柱中加入50 µl DNA 洗脱缓冲液#10009，室温静置2分钟。

12.      14000rpm离心30秒，洗脱DNA。

13.      将每个管子中的DNA离心柱取出并丢弃，离心管中的洗脱液即为纯化的DNA。样品可立即使用或保存在-20°C。

VIII.用PCR定量进行ChIP富集效率的分析

建议：

·         实验中使用带滤芯的枪头以尽可能减少污染的可能性。

·         试剂盒中所包含的对照引物特异性识别人或小鼠的RPL30基因（#7014+ #7015），既可以用于常规PCR也可以用于实时定量PCR。如果用户做的ChIP样品来源于其它他物种，建议客户设计合适的特异对照引物并优化PCR反应条件。

·         建议使用热启动Taq聚合酶以减少产生非特异PCR产物的风险。

·         PCR引物的选择很关键。引物应尽可能按照下列标准来设计：

常规PCR操作：

1.        按样品数取出合适数目的0.2 ml PCR管并做好标记。注意包括2%样品输入对照（Input）组，阳性对照（组蛋白H3样品）组，阴性对照（正常兔IgG样品）组，以及一个监控DNA污染的无DNA模板的空白组对照。

2.        在每管中加入2μl各自对应的DNA样品作为模板，即Input组需要加入稀释后的input DNA样品作为模板，而其他反应管需要按照实验设计的分组加入对应的ChIP沉淀后获得的DNA作为模板。

3.        按下面配方配制PCR反应液总管，记住计算时多算两份以补偿分管时的体积损失。配好后，向每个PCR管中加入18μl反应液混合物。

4.        设定并执行以下PCR反应程序：

5.        从每个反应管中取10 μl PCR产物，2%琼脂糖凝胶或10%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，用100 bp DNA Marker做对照。人、小鼠RPL30的PCR产物大小分别为161和159 bp。

实时定量PCR方法：

1.        选与所用定量PCR仪配套的PCR管或板，做好标记。注意加入阳性对照组蛋白H3样品组，阴性对照正常兔IgG样品组，以及监控DNA污染的不加DNA模板的空白组对照。另外在加入反应体系前，将2%样品输入对照（input）DNA做一系列稀释（无稀释，1：5稀释，1：25稀释，1：125稀释），据此可以产生标准曲线并测算PCR扩增效率。

2.        在每个反应管或孔（板上）中均加入2 μl相应DNA模板。即Input组需要加入不同稀释后的input DNA样品作为模板，而其他反应管需要按照实验设计的分组加入对应的ChIP沉淀后获得的DNA作为模板。

3.        按下面配方配制PCR反应液总管，记住计算时多算两份以补偿分管时的体积损失。配好后，向每个PCR管中加入18 μl反应液混合物。

4.        按下面程序执行PCR：

5.        用定量PCR仪自带的程序分析定量结果。并利用下列公式，根据每管Ct值进行ChIP富集效率的计算。

Enrichment percentage=2%×2^{（C[T] Input Sample – C[T] IP Sample）}

C[T] = C_T =Threshold cycle of PCR reaction