超声法染色质免疫沉淀ChIP(磁珠法)操作方法

转自 CST中国 CST博士互助平台

所需试剂

包含在试剂盒SimpleChIP® Plus Sonication Chromatin IP Kit #56383中的试剂: 

a. 甘氨酸溶液 (10X)#7005

b. ChIP细胞裂解缓冲液 (2X)(ChIP Sonication Cell Lysis Buffer) #96529

c. ChIP细胞核裂解/超声缓冲液(ChIP Sonication Nuclear Lysis Buffer)#28778

d. ChIP缓冲液 (10X) #7008

e. ChIP 洗脱(缓冲)液 (2X) #7009

f. 5 M NaCl#7010

g. ChIP级蛋白G磁珠 #9006

h. DNA结合缓冲液#10007

i. DNA漂洗缓冲液(使用前添加4倍体积无水乙醇)#10008

j. DNA洗脱缓冲液#10009

k. DNA纯化柱及收集管#10010 30个

l. 蛋白酶抑制剂混合物 PIC(200X) #7012

m. RNase A (10 mg/ml) #7013

n. 蛋白酶K (20 mg/ml)#10012

o. SimpleChIPTM 人 RPL30(Exon 3)阳性对照引物#7014

p. SimpleChIPTM 小鼠 RPL30 (Intron 2)阳性对照引物#7015

q. 组蛋白H3 (D2B12) XPTM 兔单抗 (ChIP 级别) #4620

r. 正常兔IgG #2729 

不包含在试剂盒中的试剂: 

a. 六孔磁性分离架 #7017/十二孔磁性分离架#14654

b. 甲醛(37%)(福尔马林)

c. 乙醇(96-100%)

d. 1X PBS #9872

e. 无核酸酶水 #12931

f. Taq DNA聚合酶

g. dNTP 混合液 

I. 组织样品交联与样品制备

当收取组织样品进行ChIP实验时，要尽量去除脂类，以及坏死等无关组织。组织样品可直接进行交联处理，或置于干 冰上稍后处理。为了获得更优的ChIP结果，推荐每个标准的ChIP反应需要约25mg组织样品处理后获得的染色质。而 因不同组织类型中的染色质含量有差异，为获得适量的染色质样品可根据预实验结果适当调整组织用量。请参考附表A， 查询不同类型的组织样品中的预期染色质量。

注意:预实验时，需要额外准备约5mg组织样品，进 染 质片段 化效率和染 质浓度检测，并可作为Input内参对照。 

在实际工作当中，我们建议每次实验处理足量的组织，可满足后续多个免疫沉淀反应和技术性重复要求，如单次 ChIP实验应包含与阴性对照(IgG)，阳性对照H3抗体和目的蛋白抗体等进行免疫沉淀的足量样品。您可根据自己的 实验设计，在开始实验前计算所需要的ChIP反应次数，准备相应足量的组织或细胞。因 此 ， C S T 建 议 以   个 样 品 组 为标准，准备约100到150mg组织样品(每个样品组能满 同时进 目的蛋白抗体、阴性对照IgG、阳性对照 H3抗体等多个ChIP反应的用量)。以下试剂计量按 个样品组计算。 

实验前准备 

! 取出并预热200X蛋白酶抑制剂混合物PIC#7012和10X 甘氨酸溶液#7005，确保PIC完全溶解。

! 配制含PIC的PBS。每个样品组(100到150mg组织)准备3 ml PBS (加入15 μl 200X PIC) ，置于冰上冷却。

! 配制1XChIP细胞裂解缓冲液，每个样品组(100到150mg组织)准备1ml1XChIP细胞裂解缓冲液(0.5ml2X ChIP超声裂解缓冲液 #96529+0.5 ml ddH2O+5 μl 200X PIC) ，置于冰上冷却。

!每个样品组(100到150mg组织)准备 28 μl 37%的甲醛溶液，或62.5 μl 16%的不含甲醇的福尔马林溶液;置于室温，确保新鲜未过期。

1. 称取新鲜或冻存的组织样品，每个样品组需准备样品量:100到150mg组织。

2. 把样品置于60 mm 或100 mm 培养皿中，用解剖刀或剪刀剪碎成1-2 mm大小碎块。并保持样品一直处于冰上或低温，避免蛋白降解。

3. 转移切碎的组织到15 ml 的锥底离心管中。

4. 每个样品组中加入1 ml 预冷的PBS+PIC。 

为了使蛋白与DNA交联，每个样品组(1 ml PBS+PIC)加入28 μl 37%的甲醛溶液，或62.5 μl 16%的不含甲醇的福尔 马林溶液(可根据样品量调整，保证甲醛终浓度为1%即可)。室温下低速摇动不少于10分钟。 针对检测组织样本的部分转录因子或转录辅因子，CST建议可进行如下交联优化(细节请参照附表B，图7):

• 组蛋白或组蛋白修饰靶点，推荐交联时间为10分钟即可;

• 对于转录因子，推荐交联时间为10到30分钟; 

• 对于转录辅因子，推荐交联时间为30分钟。 

5. 向每个样品组(1 ml PBS+PIC)，加入100 μl 10X 甘氨酸溶液稍加转动使之混匀，冰上孵育5分钟，以终止交 联。 

6. 4°C, 1,200 g离心5分钟收集固定后的组织样品。

7. 去除上清后，用1 ml 预冷的PBS+PIC漂洗样品一次。

8. 4°C, 1,200 g再次离心5分钟。

9. 重复7和8步骤各1次。

10. 去除上清后，重悬样品到1 ml ChIP细胞裂解缓冲液+PIC并置于冰上。

11. 转移组织悬液到Dounce匀浆器。

12. 使用匹配Dounce匀浆器的紧型槌(Type A)研磨处理20次左右，把组织样品分解成单细胞悬液无组织块可见。

13. 转移上清到离心管并立即进行后续的细胞核处理和染色质片段化处理(参照第III部分)。 

II. 细胞样品交联与样品制备
为了获得更优的ChIP结果，一个标准的ChIP反应需要约4X 106个细胞处理后获得的染色质，以HCT 116细胞为例， 375px培养皿，20 ml培养基中90%生长密度下的细胞量约为1.2X 107个细胞。在实际工作当中，我们建议每次实验 处理足量的细胞用于满足后续多个免疫沉淀反应和技术性重复要求，如单次ChIP实验应包含与阴性对照(IgG)， 阳性对照H3抗体和靶标蛋白抗体等进行免疫沉淀的足量样品。您可根据自己的实验设计，在开始实验前计算所需 要的ChIP反应次数，准备相应足量的组织或细胞。因此，CST建议以一个样品组为标准，准备约为1X 107到 2X 107细胞(每个样品组能满足同时进行目的蛋白抗体、阴性对照IgG、阳性对照H3抗体等多个ChIP反 应 的 用 量 )。以下试剂计量为一个样品组计算，此足量细胞数能满足包括低染色质含量的细胞在内的各类细胞的 ChIP实验，同时染色质量适宜进行超声片段化处理。

注意:建议在开展正式实验前，先进 预实验，以熟悉实验体系和了解并优化所用样本的各项条件。预实验 时，需要额外准备 个细胞样品组，对染 质剪切效率和浓度进 检测(参照第IV部分)。 另外，为了细胞 计数，可额外准备 盘细胞用于 球计数板法测定细胞数。 

实验前准备 

! 足量培养的细胞(请根据自己的实验需求，计算所需要的ChIP反应次数和培养细胞量)。

! 取出并预热200X蛋白酶抑制剂混合物PIC#7012和10X 甘氨酸溶液#7005，确保PIC完全溶解。

! 准备预冷的PBS，用于洗涤细胞。

! 配制含PIC的PBS，用于刮下和收集细胞。每个15 cm培养皿需要2ml PBS(加入10 μl 200X PIC) ，置于冰上冷却。

! 每15 cm培养皿需准备40ml PBS，并置于冰上。

! 每20ml 培养基需要540 μl 37%的甲醛溶液，或1.25 ml 16%的不含甲醇的福尔马林溶液(其他培养基体积可根据比例折算);置于室温，确保新鲜未过期。 

! 配制1X ChIP细胞裂解缓冲液+PIC:每个样品组(1X 107到2X 107细胞)准备1 ml 1X ChIP细胞裂解缓冲液(0.5 ml 2X ChIP细胞裂解缓冲液 #96529+0.5 ml ddH2O+5 μl 200X PIC) ，置于冰上冷却。 

1. 为了使蛋白与DNA交联，向每个含有20 ml培养基的375px培养皿中加入540 μl 37%的甲醛溶液，或1.25 ml 16% 的不含甲醇的福尔马林溶液(可根据培养基体积调整，保证甲醛终浓度为1%即可)。稍加转动培养皿使之混匀， 室温放置10分钟。加入甲醛后，培养基的颜色会发生改变。

2. 每个15 cm培养皿中加入2 ml 10X 甘氨酸溶液稍加转动使之混匀，室温孵育5分钟，来终止上述固定反应。加入 甘氨酸后，培养基的颜色会发生改变。

3. 对于悬浮细胞: 

a. 收集固定后的细胞到50 ml锥底离心管中，4°C 1,000 g离心5分钟沉淀细胞后，用冰冷的PBS漂洗两次(20 ml /次)。去除上清后立即进行后续的染色质处理(见第3b部分)。或暂停实验，细胞样品可在干冰上预冷并保存在-80°C。

b. 每2X 107细胞重悬于1 ml 1X ChIP细胞裂解缓冲液+PIC，立即进行后续的细胞核抽提和染色质超声剪切(第III部分) 

4. 对于贴壁细胞: 

a. 弃去培养基后用冰冷的普通PBS漂洗两次(20 ml /次)，每次彻底弃净PBS。

b. 每15 cm培养皿的细胞量加入2 ml冰冷的含PIC的1X PBS，将细胞刮下，并将所有固定后的细胞收集到一个15 ml的锥底离心管中。

c. 4°C，1,000 g离心5分钟收集细胞，去除上清后立即进行后续的染色质处理(见第4d部分)。或暂停实验，细胞样品可在干冰上预冷并保存在-80°C。

d. 每2X 107细胞重悬于1 ml 1XChIP细胞裂解缓冲液+PIC，立即进行后续的细胞核抽提和染色质超声剪切(第III部分) 

III. 细胞核处理和染色质剪切

注意:以下的操作流程所需的试剂用量是针对 个样品组(100到150mg组织，或1X 107到2X 107细胞)给出 所需试剂用量。我们建议同 样品组内的多管样品(用于不同抗体的ChIP沉淀反应需要)染 质处理过程可 合并  管进 ，这有利于得到均 的染 质超声片段，使用者需根据每组需要的ChIP反应总数调整试剂用 量。

实验开始前准备:

! 取出并预热200X蛋白酶抑制剂混合物PIC#7012，确保PIC完全溶解。
! 配制1X ChIP细胞裂解缓冲液+PIC:每个样品组准备1 ml 1 X ChIP细胞裂解缓冲液 (0.5 ml 2X ChIP细胞裂解缓冲液 #96529 + 0.5 ml ddH2O )+5 μl 200X PIC。

! 配制 ChIP 细胞核裂解/超声缓冲液+PIC:每个样品组准备1 ml ChIP细胞核裂解/超声缓冲液 #28778+5 μl 200X PIC。 

1. 重悬来自第I部分或第II部分的每个样本组到预冷的1 ml ChIP细胞裂解缓冲液+ PIC中，冰上孵育10分钟，每3分 钟颠倒混匀一次。

2. 4°C，5,000 g离心5分钟以沉淀细胞核。弃上清，再次将每个样品组沉淀重悬在1 ml冰冷的ChIP细胞裂解缓冲 液+ PIC中。

3. 冰上孵育样品5分钟，4°C，5,000 g离心5分钟以沉淀细胞核。注 意 :交联的组织或细胞样品可能仍处于非完全 裂解状态，直到超声处理。

4. 将沉淀用1 ml ChIP细胞核裂解/超声缓冲液 #28778+PIC 再次重悬，冰上孵育10分钟。将此样品转移到一个 适宜超声的离心管中，注 意 :交联的组织或细胞样品可能仍处于非完全裂解状态，直到超声处理。

5. 超声处理染色质片段 

超声条件需根据超声仪器的超声功率和超声间隔时间等进行优化: 一般来说，优化的超声条件是能够将60%到90%的 染色质片段随机打断到1kb以下。CST内部实验验证，延长样品交联时间会降低染色质片段化效率至约30%到60%的染 色质片段在1kb以下，但这对于部分转录因子或转录辅因子，可显著提高ChIP富集丰度(见附表B，图7;附表C，图8)。 另外，过度超声会破坏染色质上抗原表位，导致抗体富集效率降低引起的ChIP扩增信号下降等问题。 因此，CST建议 用超声处理样品时，使用可得到理想染色质片段的更少超声循环数即可。 

•  建议超声体系:重悬1 ml ChIP细胞核裂解/超声缓冲液中的样品组(100到150mg组织，或1X 107到2X 107细 胞);注意:超声体积过大或浓度过高，会导致染色质片段化效率降低。

•  使用Branson Digital Sonifier D250 probe超声仪和1/8英寸(3mm)直径微探头，设置50%振幅，超声1秒， 间隔1秒的8分钟超声循环(4分钟累计超声时间，使用者也可以根据自身需要设定每次超声的时间、间隔时间和 循环次数)，可获较好染色质片段化样品和ChIP富集效率。

•  在超声过程中，需保持样品一直处于冰上低温状态。不要使探头接触超声管底部或管壁，如超声过程产生泡沫， 需暂停超声并调整超声管位置。

6. 4°C，21,000 g离心10分钟，除去样品中的细胞核等碎片。

7. 将上清转移到一个新管子中，即为交联的染色质样品。在下一步使用之前需要保存在-80°C。取50 μl染色质样品用以分析DNA的剪切情况并确定其浓度(参照第IV部分)。 

IV. 分析染色质片段化情况及浓度(推荐步骤) 

1. 向50 μl染色质样品(来自第III部分第7步)添加100 μl无核酸酶的水，补足到150ul，然后加入6 μl 5 M NaCl #7010 和 2 μl RNase A #7013。涡旋震荡混匀，37°C孵育30分钟。

2. 向RNase A消化后的样品中加入2 μl 蛋白酶K #10012。涡旋震荡混匀， 65°C孵育2小时。

3. 按照第VII部分的说明利用离心柱纯化DNA。

4. DNA样品纯化后，取10 μl样品与DNA marker同时进行1%琼脂糖凝胶电泳以确定DNA片段大小。DNA应当被超声剪切为长度约为200 bp到数kb大小的片段(参照附表C中图7结果，根据处理的细胞/组织样品不同和检测靶 点类型差异，超声预期条件不同)。一般情况下，约60%到90%的染色质片段应该在1kb以下。请参考附表B中关 于超声条件优化的结果。 

5. 用分光光度仪测定DNA浓度。理想的DNA浓度应当在50~200 μg/ml之间。 

注意:要得到理想的ChIP结果，合适长度和浓度的染 质样品 关重要。过度超声可能会减弱PCR定量信号。 超声不 可能会导致过 的背景信号并降低分辨率。加 到IP体系中的染 质太少也可能导致不能产 PCR定量信号。优化染 质剪切条件的操作 法请参照附录B/C及附录D(常见问题及解决 案)。 

V. 染色质免疫沉淀(IP)

为了得到理想的ChIP结果，每个IP反应需要5-10 μg的交联染色质片段量，约为来自4X 106细胞或25 mg组织的染色 质片段。一般在与抗体孵育前，需要向100 μl的染色质样品中添加400 μl 1X ChIP缓冲液。但如果样品染色质浓度偏低， 即每个IP所需样品量多于100 μl时，仍需按照1:4的比例稀释样品。此情况下无需多加Protein G磁珠，可适当延长孵 育时间。

实验开始之前准备: 

! 取出并预热200X蛋白酶抑制剂混合物PIC#7012。确保PIC完全溶解。

! 预热10X ChIP缓冲液#7008，确保其中SDS完全溶解。

! 上述已制备的染色质片段样品，置于冰上。

! 配制低盐漂洗液:每个IP反应预备 3 ml 1X ChIP 缓冲液 (300 μl 10X ChIP 缓冲液 + 2.7 ml 水)，置于冰上。

! 配制高盐漂洗液:每个IP反应预备1 ml 1X ChIP 缓冲液 (100 μl 10X ChIP 缓冲液 + 900 μl 水) + 70 μl 5MNaCl #7010，置于冰上。 

1. 为免疫沉淀反应准备足够的1 X ChIP缓冲液。每个IP反应需要400 μl 1 X ChIP 缓冲液(40 μl 10X ChIP缓冲液 + 360 μl水)和2 μl 200X PIC，混匀后置于冰上。在配好的ChIP缓冲液中，每个IP反应管加入等量交联后的染色质 样品(每管对应5~10 μg的染色质DNA，来自第III部分第7步)，并用1 X ChIP 缓冲液补至每管总体积为500ul。 为了保证更高的结合效率，染色质至少需要用4倍体积的1 x ChIP缓冲液来进行稀释。在确定免疫沉淀反应数时， 每一个样品组应计算包括目的蛋白抗体管(可能为多种不同目的蛋白抗体，根据抗体种类数确定)和阴性对照管 抗体正常兔IgG #2729的反应数。同时，对于初次进行ChIP实验的用户，我们推荐每组加一个阳性对照管，即 试剂盒内提供的Histone H3 (D2B12) XP® Rabbit mAb #4620阳性对照抗体进行ChIP反应。

2. 将稀释后的ChIP染色质，每个样品管吸取10 μl样品并转移到一个新的离心管中，作为2%样品输入对照(Input)， 在后续使用之前可以保存在-20°C (Input样品后续用于第VI部分的第1步)。

3. 在各个样品管中加入对应的目的蛋白抗体，在每组阴性对照管中加入正常IgG。每种抗体用量需根据相关抗体说 明书进行添加(CST ChIP抗体通常是按照体积比进行添加)，对于本试剂盒自带阳性对照组蛋白H3 (D2B12)XP™兔单抗#4620，加入10 µl即可；因正常IgG抗体浓度通常较高，IgG加入1µl~2µl即可。将加入抗体的反应管封严，在4°C的转子上孵育4小时以上或过夜。

注意： ChIP 实验中，抗体用量很关键，过多或过少的抗体都会对靶标富集度造成负面影响。CST对提供的所有ChIP级抗体进行验证，提供更佳稀释比，建议遵循抗体说明书中的推荐稀释比添加抗体。当同时检测多个不同ChIP抗体时，建议加入匹配更高抗体用量的阴性对照正常兔IgG#2729抗体即可。