细胞的传代

细胞在250px 细胞培养皿中贴壁生长，培养皿置于CO2培养箱中。培养条件：37℃，饱和湿度，含5% CO2。倒置显微镜下观察细胞的生长情况，当细胞生长至80~90%融合时进行传代。首先将长满细胞的培养皿中原来的培养液吸出。用3ml PBS洗两次。加入1ml 0.25％胰酶消化液，使细胞都浸入溶液中。37℃，1-2min后显微镜下观察消化情况，当细胞开始变圆、细胞间隙变大时，加入2-3ml培养液终止消化。用枪头轻轻吹打，放入15ml 离心管离心（1000rpm，5min）。3ml培养液重悬沉淀，轻轻吹打混匀，1:3传代。置于CO2培养箱中培养。2~3天后用倒置显微镜观察细胞的生长情况，当细胞生长至80~90%融合时按照上述方法进行传代。

细胞的冻存

1）选对数增生期细胞，在冻存前1天换液。

2）按常规方法把培养细胞制备成悬液，计数，使细胞密度达5×107／ml左右密度，离心，弃上清。

3）加入配制好的冻存液（培养液40%，小牛血清50%，DMSO 5%-10%），按与去上清相同的量一滴一滴加入离心管中，然后用吸管轻轻吹打令细胞重悬。冻存细胞时培养液中加入保护剂10％二甲基亚砜(DMSO) 或甘油，可使冰点降低，使细胞内水分在冻结前透出细胞外。

4）分装于无菌冻存管中，每管加1-1.5ml悬液。

5）旋好冻存管并仔细检查，一定要盖紧，做好标记。

6）冻存：在特殊的仪器或简易的液氮容器中，按-1℃／min的速度，在30～40min时间内，下降到液氮表面，再停30min后，直接投入液氮中。要适当掌握下降冷冻速度，过快能影响细胞内水分透出，太慢则促进冰晶形成。 此外，推荐使用CoolCell alcohol-free细胞冻存盒，它不通过酒精或其他液体就可实现样本在-80冰箱中冷却的速率为标准化-1℃/min。

细胞的复苏

1）从罐中取出冻存管。

2）迅速放入36℃～37℃水浴，不时摇动，使其急速融化，30～60s内完成。或采用ThawSTAR 自动细胞复苏系统，能很好的确保复苏的统一和可重复性，减少污染发生。操作简单，只需将1.8或2.0mL的冻存管插入，大约2-3分钟后，复苏完成。

3）冻存管用70％酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬液注入离心管中，再滴加10ml培养液。

4）低速离心(500～1000r／min) 5min，去上清后再用培养液洗一次。

5）用培养液适当稀释后，装入250px 培养皿 37℃培养，次日更换一次培养液后，继续培养。以后仍按常规进行培养。