流式细胞术方案

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A.     所需溶液和试剂

1. 1X磷酸盐缓冲液（PBS）：将8 g氯化钠（NaCl），0.2 g 氯化钾（KCl），1.44 g 磷酸氢二钠（Na₂HPO₄），0.24 g 磷酸二氢钾（KH₂PO₄）溶解在800 ml蒸馏水（dH₂O）中。用盐酸调节pH到7.4，定容至1升。室温保存。

3. 甲醛溶液（无甲醇的）

4. 孵育缓冲液：将0.5 g牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）溶解在100 ml的1 X PBS中。保存在4°C。

B.      固定

1. 离心收集细胞，弃上清。

2. 将细胞重悬在0.5-1 ml PBS中。加入甲醛溶液至终浓度为2-4%。

3. 37°C固定10分钟。

4. 放在冰上降温1分钟。

5. 做细胞外染色不需要细胞膜打孔时，继续D1步或将细胞保存在4°C含有0.1%叠氮钠的PBS中；做细胞内染色时，继续C1步给细胞膜打孔。

C.     细胞膜打孔

1. 边轻轻震荡边将冰冷的100%甲醇缓慢加入到预冷的细胞中，至终浓度为90%。或者也可以在细胞膜打孔前离心去除固定剂，然后将细胞沉淀重悬在90%甲醇PBS溶液中。

2. 在冰上放置30分钟。

3. 进入染色步骤或是将细胞在90%甲醇PBS溶液中，-20°C保存。

D.     免疫染色

注意：单克隆抗体设立相应亚型的对照，而多克隆抗体需要对应种属的IgG作为对照。用血球计数法或是其他方法对细胞计数。

1. 将0.5-1 x 10⁶个细胞分到各检测管中（依照体积）。

2. 各管加入2-3 ml孵育缓冲液漂洗，离心回收细胞。重复一次。

3. 将每个管中的细胞重悬在100 µl孵育缓冲液中。

4. 室温，孵育缓冲液封闭10分钟。

5. 按合适的稀释比例在检测管中加入未标记，生物素标记或是荧光素标记的一抗。具体的用量参考抗体各自的说明书。

6. 室温孵育1小时。

7. 同第二步，用孵育缓冲液清洗，离心回收细胞。

8. 如果是荧光素标记的一抗，则将细胞重悬在0.5 ml PBS中然后用流式细胞仪检测。如果是未标记或者生物素标记的一抗，则继续D9步。

9. 用孵育缓冲液按推荐比例稀释荧光素标记的二抗或抗生物素蛋白avidin，将细胞重悬在该稀释液中。

10. 室温孵育30分钟。离心去除稀释液。

11. 同第二步，用孵育缓冲液清洗，离心回收细胞。

12. 将细胞重悬在0.5ml PBS中然后用流式细胞仪检测。或者继续E1步DNA染色。

E.      DNA染色（可选）

1. 将细胞重悬在0.5 ml DNA染色液中（例如 DRAQ5^® #4084）。

2. 室温至少孵育5分钟。

3. 流式细胞仪进行分析。

*推荐的二抗：

抗兔：

1. Anti-Rabbit IgG （H+L）， F（ab'）₂ Fragment （Alexa Fluor^® 488 Conjugate） #4412

2. Anti-Rabbit IgG （H+L）， F（ab'）₂ Fragment （Alexa Fluor^® 555 Conjugate） #4413

3. Anti-Rabbit IgG （H+L）， F（ab'）₂ Fragment （Alexa Fluor^® 647 Conjugate） #4414

抗小鼠：

1. Anti-Mouse IgG （H+L）， F（ab'）₂ Fragment （Alexa Fluor^® 488 Conjugate） #4408

2. Anti-Mouse IgG （H+L）， F（ab'）₂ Fragment （Alexa Fluor^® 555 Conjugate） #4409

3. Anti-Mouse IgG （H+L）， F（ab'）₂ Fragment （Alexa Fluor^® 647 Conjugate） #4410

抗大鼠：

1. Anti-Rat IgG （H+L）， （Alexa Fluor^® 488 Conjugate） #4416

2. Anti-Rat IgG （H+L）， （Alexa Fluor^® 555 Conjugate） #4417

3. Anti-Rat IgG （H+L）， （Alexa Fluor^® 647 Conjugate） #4418