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IHC 实验操作步骤
免疫组化方法（石蜡切片）
转自CST中国 CST博士互助平台
*重要提示：参考抗体说明书选用合适的抗体稀释液和抗原修复处理方法。IHC方法：抗原修复缓冲液/抗体稀释液
A. 所需溶液和试剂
1. 二甲苯
2. 无水乙醇（100% 和 95%，变性无水乙醇，组织学级）
3. 去离子水（dH2O）
4. 苏木精（可选）
5. 漂洗（缓冲）液：
1X TBS/0.1% Tween-20 (1X TBST)：配制时，取100 ml 10X TBS加900 ml水稀释至1升。加入1 ml Tween-20，混匀。
10X Tris缓冲盐水(10X TBS)：在800 ml蒸馏水中加入24.2 g 三羟甲基氨基甲烷（Trizma base, C4H11NO3）和80 g 氯化钠（NaCl）。用浓盐酸将pH调节到7.6，定容至1 L。
6. *抗体稀释液
a. SignalStain® 抗体稀释液 #8112
b. TBST / 5%正常山羊血清： 5 ml 1 X TBST 中添加250 µl正常山羊血清。
c. PBST / 5%正常山羊血清： 5 ml 1 X PBST 中添加250 µl正常山羊血清。
1 X PBS / 0.1% Tween-20 (1 X PBST): 配制时，取100 ml 10X PBS加900 ml水稀释至1 L。加入1 ml Tween-20，混匀。
10X 磷酸盐缓冲液 (10X PBS): 在800 ml水中加入80 g 氯化钠（NaCl）, 2 g 氯化钾（KCl）, 14.4 g 磷酸氢二钠（Na2HPO4）和2.4 g 磷酸二氢钾（KH2PO4）。调整pH到7.4，定容至1 L。
7. *抗原修复：
a. 柠檬酸盐：10 mM柠檬酸盐缓冲液：称取2.94g二水合柠檬酸钠（C6H5Na3O7•2H2O）溶解在800 ml水中。调整pH为6.0，定容至1 L。
b. EDTA: 1mM EDTA: 称取0.372 g EDTA (C10H14N2O8Na2•2H2O) 溶解在800 ml水中。调整pH为8.0，定容至1 L。
c. TE：10 mM Tris/1 mM EDTA, pH 9.0: 配制时，称取1.21 g Trizma®碱（C4H11NO3）和0.372 g EDTA (C10H14N2O8Na2•2H2O) 溶解在950 ml蒸馏水中。调整pH到9.0，然后用蒸馏水定容至到1 L。
d. 胃蛋白酶：1 mg/ml，溶解在pH为2.0的Tris盐酸缓冲液中。
8. 3%过氧化氢：配制时，将10 ml 30% H2O2加入到90 ml蒸馏水中。
9. 封闭液：TBST/5%正常山羊血清：5 ml 1X TBST中添加250 µl正常山羊血清。
10. 检测系统：根据厂家说明书使用。已有的检测系统：
SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) #8114
SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Mouse) #8125
注意: 如果本产品没有使用本试剂优化过，可能需要通过滴定法来确定更佳条件。
11. DAB试剂或合适的底物：按产品说明配制。
B. 脱蜡处理/再水化
注意：操作中任何时候都不要晾干玻片
1. 脱蜡处理/切片的水化：
a. 用二甲苯浸洗切片3次，每次5分钟。
b. 用无水乙醇浸洗切片2次，每次10分钟。
c. 用95%乙醇浸洗切片2次，每次10分钟
2. 在蒸馏水中漂洗2次，每次5分钟。
C. *抗原修复
注意：参考抗体说明书选用合适的抗原修复缓冲液，按以下步骤操作。
1. 柠檬酸缓冲液处理：加热浸泡在10 mM pH 6.0的柠檬酸盐缓冲液中的玻片，使之维持在准沸腾的温度（95-99°C）10分钟。取出放在实验台上自然冷却30分钟。
2. EDTA处理：加热浸泡在1 mM pH 8.0 EDTA溶液中的玻片，使之维持在准沸腾的温度（95-99°C）15分钟。不需另加冷却步骤。
3. TE处理：加热浸泡在pH 9.0的10 mM TE/1 mM EDTA溶液中的玻片，使之维持在准沸腾的温度（95-99°C）18分钟。取出放在实验台上自然冷却30分钟。
4. 胃蛋白酶处理：37°C消化10分钟。
D. 染色
注意：查询产品说明书推荐的抗体稀释比例。
1. 切片用漂洗液洗两次，每次5分钟。
2. 浸泡在3% H202中孵育10分钟
3. 用蒸馏水漂洗两次，每次5分钟。
4. 用漂洗液洗5分钟
5. 在切片上滴加100-400 μl封闭液，室温封闭1小时。
6. 去掉封闭液，每个切片上加100-400 µl稀释的一抗。4°C孵育过夜。
7. 去掉抗体稀释液。用漂洗液洗3次，每次5分钟。
8. 根据厂家说明书，用合适的检测系统检测。
9. 用漂洗液洗3次，每次5分钟。
10. 加入100–400 µl DAB或合适的底物，近距离检测染色进展。
11. 一旦切片染色成功，立刻将玻片浸入水中。
12. 如有需要，将切片泡在苏木精溶液中复染，按照产品说明进行。
13. 切片用蒸馏水洗两次，每次5分钟。
14. 切片脱水：
a. 在95%乙醇中孵育两次，每次10秒。
b. 在100%乙醇中孵育两次，每次10秒。
c. 在二甲苯中孵育两次，每次10秒。
15. 加上盖玻片。
免疫组化方法（冰冻切片）
A. 所需溶液和试剂
1. 二甲苯
2. 无水乙醇（100% 和 95%，变性无水乙醇，组织学级）
3. 苏木精（可选）
4. 固定剂：请参考产品说明书选取合适的固定剂。
a. 10%中性福尔马林
b. 丙酮
c. 甲醇
d. 3%甲醛溶液：配制时，将18.75 ml 16%甲醛溶液加入到81.25 ml 1X PBS中。
5. 10X Tris缓冲盐水（10X TBS）：在800 ml蒸馏水中加入24.2 g 三羟甲基氨基甲烷（Trizma base ，C4H11NO3）和80 g 氯化钠（NaCl）。用浓盐酸将pH调节到7.6。
6. 漂洗（缓冲）液：1 X Tris缓冲盐水（TBS）。100 ml 10 X TBS加900 ml水至1L。
7. 甲醇/过氧化氢：配制时，将10 ml 30% H202加入到90 ml甲醇中。保存在-20°C。
8. 封闭液：1X TBS / 0.3% Triton-X 100 / 5%正常山羊血清。配制时，将500 µl山羊血清和30 µl Triton-X 100加入到9.5 ml 1X TBS中。
9. 检测系统：根据厂家说明书使用。已有的检测系统*。
10. DAB试剂或合适的底物：按产品说明配制。
B. 切片
1. 对于保存在-80°C的样品：切片前先从冰箱中取出放在-20°C平衡15分钟左右。这可以避免切片时样品断裂。
2. 将样品切成大约6-8 µm厚，铺在带正电性的玻片上。
3. 固定前，可以把切片摊开放在实验台上风干几分钟。（这有助于切片贴紧玻片）
C. 固定
注意：参考产品说明书（抗体）选择合适的固定剂
1. 玻片上的切片风干后，选用如下合适的固定剂进行固定。
a. 10%中性福尔马林：室温10分钟。立即进行染色操作。
b. 冰丙酮：-20°C 10分钟。风干。立即进行染色操作。
c. 甲醇：-20°C 10分钟。立即进行染色操作。
d. 3%甲醛溶液：室温15分钟。立即进行染色操作。
e. 3% 甲醛/甲醇：先在室温下3%甲醛中固定15分钟，然后在-20°C的甲醇中固定5分钟（中间不漂洗）。立即进行染色操作。
D. 染色
1. 切片用漂洗液洗两次，每次5分钟。
2. 室温下，浸泡在3% H202/甲醇中孵育10分钟
3. 用漂洗液洗两次，每次5分钟。
4. 在切片上滴加封闭液，室温封闭1小时。
5. 按抗体说明书的推荐比例将抗体稀释在封闭液中。
6. 去掉切片上的封闭液，每个切片上加100-400 µl稀释的一抗。4°C孵育过夜。
7. 去掉抗体。用漂洗液洗3次，每次5分钟。
8. 根据厂家说明书，用合适的检测系统*检测。
9. 用漂洗液洗3次，每次5分钟。
10. 加入100–400 µl DAB或合适的底物，近距离检测染色进展。
11. 一旦切片染色成功，立刻将玻片浸入水中。
12. 如有需要，将切片泡在苏木精溶液中复染，按照产品说明进行。
13. 切片用蒸馏水洗两次，每次5分钟。
14. 切片脱水：
a. 在95%乙醇中孵育两次，每次10秒。
b. 在100%乙醇中孵育两次，每次10秒。
c. 在二甲苯中孵育两次，每次10秒。
15. 加上盖玻片。
*已有的检测系统：
SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) #8114
SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Mouse) #8125
