QUESTION

ANSWER

本研究结合PacBio HiFi 测序及WGS测序，首次报道了FGF14双等位基因（GAA）202/222可能致病；在母系传递过程中，FGF14的GAA重复范围可由非致病区间（GAA）200–249扩展为致病区间（GAA）≥250。这些发现极大丰富了SCA的遗传和表型谱，为SCA27B的基因诊断和遗传咨询提供了重要依据。

参与此次队列研究的为2013年至2022年中南大学湘雅医院神经内科纳入的1216例指标病例，包括399例典型LOCA (迟发性小脑共济失调，发作年龄 > 30岁) ，290例EOCA (早发性小脑共济失调，发作年龄≤30岁)和527例占主导地位的典型小脑共济失调（MSA-c ）患者，并通过long-range PCR和RP-PCR进行FGF14 GAA 扩增的筛选。在1216名患者中，93.8% (n = 1141)的患者携带8~234个GAA repeat 的等位基因(图1a 和 b)。有趣的是，通过PacBio HiFi 长读长测序（target LRS）发现，来自LOCA 队列(P-1和 P-2)的一对同胞兄弟被发现是(GAA)202和(GAA)222等位基因的复合杂合子，两者都在40岁时呈现出缓慢进行性小脑共济失调并伴有步态共济失调、上肢共济失调和构音障碍。其他该家族成员的共分离分析显示(GAA)202和(GAA)222等位基因可能不是致病性的，但(GAA)202/222等位基因的复合杂合性可能与典型的GAA-FGF14共济失调相关。

图1 GAA-FGF14基因扩张的遗传分布、long-range PCR、repeat-primed PCR和遗传不稳定性。(a)在典型的 LOCA，EOCA 和 MSA-c 队列中FGF14基因中长三联重复单位的百分比和数量的分布。对于正常 GAA 重复(b) ，(GAA)≥250扩增(c)和(GAA)≥250扩增(d)的患者的对照，long-range PCR和repeat-primed PCR结果。(e)在9个不同的母体减数分裂事件中(GAA)≥250扩增传递的重复长度变异。(f) GAA-FGF14基因扩增在一个家庭中的两代传播

在1216例指标病例中，其余75例先证者被发现携带至少250个三核苷酸重复的FGF14 GAA 扩增(21例典型 LOCA、29例EOCA和25例MSA-c）（图2）。他们其中有4例LOCA患者(P12，P-14，P-15和 P-16) 、3例EOCA 患者(P-3，P-4和 P-11)和3例MSA-c患者(P-17，P-18和 P-19)携带有不间断的纯GAA扩增，范围从250~302个重复。在其他65例携带中断非GAA纯扩增的患者中，56例接受了随后的PacBio HiFi 靶向长读长测序（靶向LRS），9例由于DNA数量或质量不足而被排除在外。靶向LRS结果显示，14例典型LOCA 患者、21例EOCA患者和21例MSA-c患者携带有一个[(GAA) n (GCA) m ] z 扩增，总三核苷酸重复次数为296~726次，GCA重复次数为41~273次(图3)。其中，EOCA (P6和P-8)的两个先证者携带与疾病共分离的(GAA)≥250 - [(GAA) n (GCA) m ] z 扩增。其他54名患者(14典型LOCA，19名EOCA和21名MSA-c)携带[(GAA) n (GCA) m ] z 扩增而不含(GAA)≥250扩增，其不与疾病表型共分离。在研究者使用的内部对照数据库(3/150)中也存在不含(GAA)≥250的[(GAA) n (GCA) m ] z 扩增，表明这种扩增与＜250个纯GAA的重复序列可能是多态性而不是致病性的。

图2 GAA-FGF14阳性病例的家系图和共现筛查。(a)13例 GAA-FGF14阳性家系。家族4和家族5的患者在FGF14基因中有(GAA)≥250-[(GAA) n (GCA) m ] z 扩增。(b)在家族2中，先证者(P-3)被Sanger测序鉴定为在 COL1A2基因中具有 c.1801 G > A 的杂合变异。(c)在家族3中，通过 Sanger 测序进行的共分离分析显示，父母双方在NEU1基因中具有 c.544 A > G 的杂合变体。(d)在家族4中，先证者(P-6)在ATXN3基因中被鉴定为(CAG)78扩增。(e)在家庭5中，先证者(P-8)和她的妹妹(P-9)被鉴定为在 ATXN1基因中具有(CAG)50扩增

图3 靶向LRS显示FGF14基因 GAA-GCA和GAA基序的复杂结构。(a) IGV快照显示具有杂合重复扩增的代表性患者(ID57)。(b)序列条形图描绘了在四个样品中观察到的较短等位基因的大小，包括常见的5’-侧翼序列变体(TAGTCATAGTACCCCAA)1和GAA重复。(c)基序柱状图显示了在这些样品中观察到的较长等位基因的基序构象。内部STR三核苷酸主要由GAA和GCA组成，包括不同形式的GAAGCA和(GAA)4GCA，并被GA和GAAA中断。(d) IGV图描绘了ID01(P-1)样品中的双等位基因(GAA)202/222扩增

临床谱和亚组分析19例阳性和可能阳性患者，根据其临床表型分为 LOCA 亚组(n = 9) 、EOCA 亚组(n = 6)和 MSA-c 亚组(n = 4)。在 LOCA 亚组中，6例来自典型的LOCA队列、3例来自EOCA家族，表现为迟发性缓慢进行性小脑共济失调。他们的临床特征与在欧洲 GAA-FGF14共济失调队列中观察到的相似。其余10例显示非典型GAA-FGF14共济失调，包括6例EOCA表型(均来自 EOCA 队列)和4例MSA-c表型(1例来自典型 LOCA 队列，3例来自MSA-c 队列)。有趣的是，在家族10中，家族成员呈现缓慢进行性LOCA表型，但先证者(P-16)表现出MSA-c表型，表明先证者中可能存在继发性MSA-c。因此，来自家族10的先证者被分类为MSA-c 亚组。

LOCA、EOCA和MSA-c亚组GAA重复的中位数分别为294(范围从250~357个GAA重复) 、335(范围从277~416个GAA 重复)和267(范围从264~275个GAA 重复)。与MSA-c亚组相比，EOCA亚组显著表现出更高的GAA 重复次数。与欧洲GAAFGF14共济失调队列61岁(37-78岁)发病的中位年龄相比，在此次研究的LOCA亚组中，发病的中位年龄为47岁(40-60岁)。所有患者中最常见的永久性共济失调特征是步态共济失调(9/9,100%)和凝视诱发的水平眼球震颤(7/7,100%) ，而6例患者出现发作性症状，包括眩晕或头晕(4/9,44%) ，发作性共济失调(3/7,43%)(图4)。

图4  LOCA，EOCA 和 MSA-c 表型患者的临床特征

在这项研究中，作者探索了我国GAA-FGF14共济失调的遗传和临床谱，发现在大型中国LOCA 队列中 FGF14 GAA 扩增的频率为1.3% ，低于以前在非亚洲共济失调人群中报道的频率。由于不同的遗传基础，GAA-FGF14阳性的LOCA，EOCA和MSA-c病例表型在发病年龄、临床特征和疾病进展方面存在差异。

利用PacBio HiFi测序技术得到的一个新发现是：重复次数少于250次的双等位基因(GAA)202/222与其他遗传或疾病(特别是在具有非典型表型的情况下)共同出现可能会更加导致疾病发作和表型变异。

PacBio HiFi技术与二代测序技术相比，因其读长可达25kb、无GC偏好性且单分子准确率≥99.9%、可以全面检测出包括SNP、Indel、SV、串联重复、CNV等在内的所有变异类型，因此在本研究中能够对重复序列有效且准确的检测。

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