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组织ChIP样本制备——Covaris 一站式解决方案

2022-05-16

组织ChIP样本制备的难点

ChIP—染色质免疫共沉淀技术，作为研究生理状态下DNA与蛋白质互作的实验技术，利用抗原抗体反应的特异性，可以真实地反映蛋白质与基因组DNA结合的状况。该技术主要用于表观遗传学研究以及转录因子调控机制研究。

在样本制备方面，有几个影响组织ChIP重复性和分辨率的关键因素：

1. 组织固定

组织固定用于保持蛋白质和DNA的相互作用状态，在固定过程中，固定剂的选择与固定时间对实验结果都至关重要。固定过度容易导致染色质片段化不充分，影响IP效率和ChIP 分辨率，固定时间不够，导致交联不完全，容易产生假阴性。那么，在组织固定这一步，甲醛只能使用37%的多聚甲醛吗？不同的组织不同的样本质量如何优化固定时间？

2. 组织匀浆

组织匀浆用于染色质释放，在解构复杂生物样品的同时保持目标分子的完整性，是提高得率、获得可重复样品制备的关键。这对分析稀有或临床样品更为重要。

3.染色质片段化

为确保ChIP 实验有良好的精度，一般片段化在300-600bp均能获得较好的ChIP结果。高重复性、随机剪切、染色质片段大小分布均匀、恒定温控是理想的染色质剪切要求。如何达到这一要求呢？

Covaris为您提供完备的组织ChIP样本制备方案！

Covaris针对组织ChIP专门研发了 “truChIP Chromatin Shearing Tissue Kit”试剂盒！试剂盒内有详细的操作步骤及优化建议：

1.固定时间优化建议

针对20~120mg组织：

① 将组织分割为 1 立方毫米的小块进行固定；

② 使用终浓度为1%的单体甲醛（实验室常用的37%的多聚甲醛含有甲醇，容易固定过度）；

③ 建议的固定时长为5min；

针对超过120mg的组织：建议使用CryoPrep™ CP02 冷冻粉碎仪先进行组织粉碎，获得均匀的粉末后再进行固定，以达到更好的固定效果。

（详细protocol请参考以下链接：https://www.covaris.com/wp/wp-content/uploads/resources_pdf/pn_010385.pdf）

2. CryoPrep™ CP02 解决组织粉碎难题

如何快速低温粉碎样本？看CryoPrep™ CP02 冷冻粉碎仪一捶帮您搞定！只需20毫秒！CP02在样本制备，尤其是珍贵微量样本制备上都有着不俗表现——提供高度均一化的样本以及高质量的核酸。提高样本前处理水平，才能进而提高下游的实验质量。（点这里看详细介绍高手过招：1秒钟，组织样本变干粉）

3. 稳定的染色质剪切结果

染色质剪切是ChIP实验中至关重要的一步，建议使用超声方法。Covaris AFA聚焦超声系统，是在传统超声波处理基础上的技术革新，通过球面固态超声波发生器将声波聚焦到样本区域，能量精确可控：

①可将染色质片段化为300~600bp之间，片段分布均匀，重复性高；

②温度恒定，保护蛋白抗原表位，提高IP和DNA回收率；

③非接触式处理，无交叉污染；

④高频低能的聚焦声波，以极低的能量输入获得良好的处理效果，避免传统超声能量过剩可能引起的样本处理过度及热损伤；

⑤通量可扩展，从单个样本到96个样本，Covaris 提供多种型号设备。

Covaris在染色质剪切方面能够做到片段化重复性高、剪切无比偏好，片段长度分布均匀，为样本处理提供高效可控、重复性优良、温度恒定及无污染的处理环境。

Covaris为您打包了整套组织ChIP样本制备实验方案，帮您将实验条件的摸索时间降低到1-2周，节约您珍贵的样本和时间。同时提高您实验数据的质量，为您提供高重复性，稳定准确的实验结果！

举个栗子

非编码体细胞突变在卵巢癌发育过程中破坏了PAX8转录网络

来自美国加州Samuel Oschin癌症中心的Matthew L. Freedman研究团队，在Nature Communications上发表文章“Non-coding somatic mutations converge on the PAX8 pathway in ovarian cancer”，揭示了体细胞非编码区突变对卵巢癌发生的影响。作者使用H3K27ac ChIP-seq和RNA-SEQ建立了初级卵巢癌的表观基因组和转录图谱，然后将这些图谱与232个卵巢癌的全基因组测序数据整合在一起后，发现了25个频繁突变的调控元件。

在这篇文章中，研究人员使用的卵巢癌样本均来自于临床，量少且不可再生，作者仅仅使用了3mm的卵巢癌核心组织，在Covaris CryoPrep冷冻粉碎仪上进行组织破碎。后使用Covaris E210 超声破碎仪进行染色质剪切获得300-500bp的核酸片段。

该文中，使用的covaris E210已服役超过10年，超声波发生器并未发生衰减，仍能提供优秀的片段化结果！

抗雄激素阻断疗法前列腺癌的发生机制

来自美国Dana-Farber癌症研究所的Freedman团队利用拷贝数改变、染色体构象捕获、基因组编辑和ChIP-seq 进行综合分析，确定了雄激素受体基因座上游增强子的激活和扩增会促进转移性抗雄激素阻断疗法前列腺癌的发展。

在该研究中，研究人员也使用了来自临床的前列腺组织。同样受限于样本量，研究人员最终只使用了2mm的核心组织用于ChIP 实验，面对如此微量的样本，Covaris CryoPrep冷冻粉碎仪+Covaris E220超声破碎系统是作者的不二选择！该实验结果最终发表在Cell上。

神经元PAS1/3 突变的分子病理生理学

发表在Biological Psychiatry上的文章Neuronal PAS Domain Proteins 1 and 3 Are Master Regulators of Neuropsychiatric Risk Genes通过ChIP-seq和RNA-seq 技术揭示了由 NPAS1 和 NPAS3 调节的基因的清晰、无偏好性的图谱，并表明这些转录因子是神经精神功能的主要调节因子。

该研究中涉及的ChIP实验，作者仅仅使用了1mm²的神经组织，依靠Covaris CryoPrep冷冻粉碎仪进行组织粉碎及细胞破碎，使用Covaris E220进行染色质剪切。

Covaris提供的完备的组织ChIP样本制备方案协助全球诸多科研工作者实现“ChIP自由”，相信也能帮到屏幕前的您！

Covaris公司一直致力于研发基于声学、机械及分子生物学的高性能组织样本处理系统，旨在帮助研究者实现快速、稳定、高效样品的预处理。基因有限公司作为Covaris在中国的合作伙伴和全国代理商，为您提供DNA片段化、ChIP实验、FFPE样本核酸提取、蛋白提取解决方案等。快戳下图获得更多第一手资料吧！可以申请试用哦~

参考文献：

[1]Corona R I , Seo J H , Lin X , et al. Non-coding somatic mutationsconverge on the PAX8 pathway in ovarian cancer[J]. Nature Communications, 2020,11(1).

[2]Takeda D Y , SpisákSándor, Ji-Heui S , et al. A Somatically AcquiredEnhancer of the Androgen Receptor Is a Noncoding Driver in Advanced ProstateCancer[J]. Cell, 2018:S0092867418306494-.

[3]Michaelson J J , Shin M K , Koh J Y , et al. Neuronal PAS Domain Proteins1 and 3 Are Master Regulators of Neuropsychiatric Risk Genes.[J]. 2017